Thạc Sĩ Xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính rhG-CSF (Recombinant Humangranulocyte colony stimulating fac

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Năm 2011

MỤC LỤC ( Luận văn dài 99 trang có File WORD)

MỤC LỤC .i
DANH MỤC CÁC HÌNH iii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
LỜI MỞ ĐẦU . 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU . . 3
1.1. Nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF 4
1.1.1. Giới thiệu 4
1.1.2. Chức năng của protein G-CSF . 4
1.1.3. Ứng dụng của protein G-CSF trong trị liệu 6
1.1.4. Một số sản phẩm G-CSF thương mại . 8
1.2. Thử nghiệm sinh học G-CSF . 10
1.2.1. Thử nghiệm sinh học in vitro . 10
1.2.2. Thử nghiệm sinh học in vivo 11
1.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro 13
1.3.1. Các dòng tế bào được sử dụng cho thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro 13
1.3.2. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm in vitro . 14
1.3.3 Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vitro . 18
1.4. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vivo . 18
1.4.1. Các mô hình động vật được sử dụng 18
1.4.2. Các thử nghiệm tác động của G-CSF trên mô hình động vật 20
1.4.3. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm G-CSF in vivo 21
1.4.4. Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vivo 22

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
2.1. Vật liệu . 24
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 24
2.1.2. Hóa chất 24
2.1.3. Môi trường 28
2.1.4. Nguyên vật liệu . 30
2.2. Phương pháp . 31

2.2.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro . 31
2.2.2. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vivo . 35

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN . 40
3.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro 41
3.1.1. Quan sát hình thái và mật độ tế bào M-NFS-60 dưới tác động của protein G-CSF
3.1.2. Khảo sát mối tuơng quan giữa khả năng tăng trưởng của tế bào và nồng độ G-CSF
3.1.3. Khảo sát mật độ tế bào tiến hành thử nghiệm sinh học 43
3.1.4. Khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học 45
3.1.4. Đề xuất quy trình xác định hoạt tính G-CSF 47
3.1.5. Đánh giá quy trình xác định hoạt tính G-CSF 50
3.2. Áp dụng quy trình để xác định hoạt tính G-CSF tái tổ hợp 52
3.2.1. Mẫu protein trước tinh chế 53
3.2.2. Mẫu protein sau tinh chế . 57
3.2.3. Mẫu protein đông khô . 58
3.3. Khảo sát xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính G-CSF in vivo . 60
3.3.1. Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng thuốc
Cyclophosphamide (CPA) 60
3.3.2. Khảo sát nồng độ G-CSF tối ưu dùng cho thử nghiệm hoạt tính in vivo . 64
3.3.3. Xây dựng mô hình đánh giá tác động của G-CSF theo phác đồ điều trị . 67
3.4. Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp in vivo . 69
3.4.1. Đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp 69
3.4.2. Đánh giá tác động G-CSF tái tổ hợp theo phác đồ điều trị . 71

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 73
4.1. Kết luận 74
4.2. Đề nghị . 75
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 77
PHỤ LỤC 81



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Chế độ điều chỉnh liều G-CSF . 7
Bảng 3.2. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu .44
Bảng 3.3. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu .46
Bảng 3.4. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu G-CSF kiểm tra 51
Bảng 3.5. Kết quả đo OD450 –OD595 các mẫu thử nghiệm .55
Bảng 3.6. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu trước tinh chế .57
Bảng 3.7. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu sau tinh chế 58
Bảng 3.8. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu đông khô .60
Bảng 3.9. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và nồng độ CPA 61
Bảng 3.10. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và chế độ tiêm CPA .63
Bảng 3.11. Tương quan giữa % tăng bạch cầu trung tính và nồng độ G-CSF .65
Bảng 3.12. Sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính (%) sau khi tiêm Leukocim theo phác đồ điều trị .68
Bảng 3.13. Lượng bạch cầu trung tính (%) ở các mẫu thử nghiệm .70
Bảng 3.14. Lượng bạch cầu trung tính (%) tương ứng với các mẫu thử nghiệm sau khi tiêm theo phác đồ điều trị. .71




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Vai trò kích thích tạo máu của các nhân tố tăng trưởng 5
Hình 1.2. Một số sản phẩm G-CSF thương mại . 8
Hình 1.3. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 11
Hình 1.4. Quy trình phát triển thuốc tại Mỹ .12
Hình 1.5. Giá trị Hill slope chuẩn trong thử nghiệm sinh học kích thích 15
Hình 1.6. Đường cong tương quan giữa nồng độ mẫu và mức đáp ứng của tế bào .16
Hình 1.7. Giá trị ED99, ED90, ED50 biểu thị trên đường cong tương quan giữa sự tăng trưởng tế bào và nồng độ mẫu .17
Hình 1.8. Các động vật được sử dụng làm mô hình thí nghiệm .19
Hình 2.9. Phản ứng dehydrogenase ở tế bào sống biến đổi WTS-8 thành sản phẩm màu (formazan) .27
Hình 2.10. Đường cong tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy in vitro .33
Hình 2.11. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm một lần 36
Hình 2.12. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm liên tục. 37
Hình 2.13. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm không liên tục .37
Hình 3.14. Tác động kích thích tăng sinh dòng tế bào M-NFS-60 của các mẫu .41
Hình 3.15. Xác định mật độ tế bào bằng CCK-8 .42
Hình 3.16. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF .43
Hình 3.17. Đồ thị thể hiện sự tăng trưởng của dòng tế bào M-NFS-60 tương ứng
dãy nồng độ G-CSF với mật độ tế bào ban đầu là 5.104, 105, và 5.105tế bào/ml .44
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tác động của thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học lên dòng tế bào M-NFS-60 .46

Hình 3.6. Tác động của các mẫu đến hình thái và mật độ tế bào 50
Hình 3.7.A. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu protein 51
Hình 3.7.B. So sánh tác động kích thích tăng sinh tế bào giữa các mẫu BSA, Neupogen và mẫu chuẩn Leukocim 51
Hình 3.8. Tác động của các mẫu G-CSF đến hình thái và mật độ tế bào 54
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra mẫu D 54
Hình 3.10. Kết quả định tính mẫu G-CSF .55
Hình 3.11. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu G-CSF .56
Hình 3.12. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu
G-CSF chuẩn và nồng độ mẫu sau tinh chế 58
Hình 3.13. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào với nồng độ mẫu
G-CSF chuẩn và mẫu đông khô 59
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu tổng theo nồng độ CPA 62
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự thay đ ổi sốlượng bạch cầu tổng theo chế độ tiêm CPA .64
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với nồng độ G-CSF 66
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm Leukocim theo phác đồ điều trị .68
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với
các mẫu thử nghiệm 70
Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm theo phác đồ điều trị tương ứng với các mẫu thử nghiệm 72


LỜI MỞ ĐẦU

Neutropenia là hiện tượng suy giảm bạch cầu trung tính, gây suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong số các nguyên nhân gây neutropenia, hóa trị và xạ trị ung thư là nguyên nhân chủ yếu nhất. Hiện nay, ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có xu hướng gia tăng dẫn đến con số bệnh nhân mắc phải neutropenia sẽ tăng cao đột biến trong tương lai sắp tới. Ngoài những tác hại chủ yếu như làm suy giảm hệ thống miễn dịch của cơ thể, khiến cho bệnh nhân dễ dàng bị nhiễm khuẩn, mắc phải các căn bệnh cơ hội, neutropenia còn gây ảnh hưởng không nhỏ đến việc điều trị ung thư. Trước tiên neutropenia làm gián đoạn phác đồ trị liệu ung thư, kéo dài thời gian bệnh. Sau đó, sẽ làm tăng chi phí chữa trị, nhất là chi phí nằm viện.
Trong các phương pháp điều trị neutropenia như cấy ghép tủy, sử dụng kháng sinh , việc sử dụng nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF đang là một liệu pháp hữu hiệu và phổ biến với các ưu điểm: chi phí thấp, tác dụng tốt, thời gian trị bệnh ngắn. G-CSF là một cytokine có bản chất glycoprotein có chức năng chính trong sự điều hoà sản xuất bạch cầu hạt trung tính thông qua kích thích tăng sinh và biệt hoá của các tế bào tiền thân bạch cầu hạt trung tính. Vì thế, việc sử dụng G-CSF trong phòng bệnh cũng như trị liệu neutropenia đang được phát triển mạnh. Các sản phẩm thuốc G-CSF có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh neutropenia đến 50%. Ngoài khả năng kích thích sản xuất giúp phục hồi số lượng bạch cầu hạt trung tính, G-CSF còn tác động lên chức năng của bạch cầu hạt trung tính như tăng cường hoạt tính thực bào, khả năng diệt vi khuẩn . do đó gián tiếp giúp cơ thể chống lại nguy cơ nhiễm. Các chế phẩm G-CSF sẽ là triển vọng cho điều trị neutropenia, đặc biệt là kết hợp trong hoá trị liệu ung thư.
Hiện nay thuốc G-CSF được lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là nhập từ nước ngoài có giá khá cao so với thu nhập của người dân nên gây hạn chế trong việc sử dụng điều trị rộng rãi. Việc bản quyền sản xuất G-CSF của công ty Amgen đã hết hạn vào tháng 3/2006 đã mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam tiếp cận và nghiên cứu sản xuất G-CSF phục vụ cho nhu cầu trong nước với giá thành thấp. Trước tình hình thực tiễn này, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử A, trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp. Với đặc tính là một protein trị liệu sử dụng trên người, theo các quy định của dược điển, sản phẩm tạo ra phải đáp ứng các chỉ tiêu như: hàm lượng, cấu trúc, độ tinh sạch, hoạt tính sinh học Trong đó hoạt tính sinh học là một chỉ tiêu quan trọng đảm bảo chất lượng sản phẩm trước khi thương mại hóa. Đây là điều kiện tiên quyết trong các quá trình sản xuất thuốc cho người.
Nằm trong khuôn khổ của đề tài, luận văn này được thực hiện với mục đích xây dựng các quy trình thử nghiệm hoạt tính G-CSF tái tổ hợp nhằm phục vụ cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm G-CSF trong các giai đoạn của quy trình sản xuất thuốc.
Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn gồm các nội dung sau:
- Khảo sát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro.
- Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp trong các giai đoạn sản xuất.
- Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch dùng cho thử nghiệm in vivo.
- Khảo xát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vivo và mô hình đánh giá tác dụng điều trị bệnh của G-CSF.
- Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của thuốc trên cơ thể động vật.