Luận Văn Xây dựng quy trình tạo dòng và lên men thu nhận protein t4 endonuclease v trong hệ thống biểu hiện e

Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT . i
DANH MỤC CÁC BẢNG . iv
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ . v
MỞ ĐẦU . 1
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 UNG THƯ DA . 3
1.1.1 Khái niệm 3
1.1.2 Phân loại 3
1.1.2.1 Ung thư tế bào đáy 3
1.1.2.2 Ung thư tế bào vẩy 4
1.1.2.3 Ung thư tế bào hắc tố 4
1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư da 5
1.1.4 Tác hại của tia UV . 5
1.1.4.1 Hình thành phân tử pyrimidine dimer (PD) 5
1.1.4.2 Cơ chế sửa sai phân tử pyrimidine dimer 7
1.1.5 Tình hình ung thư da trên thế giới và ở Việt Nam 10
1.2 ENZYM T4 ENDONUCLEASE V . 12
1.2.1 Cấu trúc . 12
1.2.2 Quá trình enzym T4 endonuclease V nhận biết chuyên biệt PD . 14
1.2.2.1 Enzym trượt không đặc hiệu trên phân tử DNA chứa PD 14
1.2.2.2 Enzym dừng lại tại vị trí PD . 14
1.2.2.3 Enzym nhận biết chuyên biệt với PD . 15
1.2.3 Hoạt tính xúc tác của enzym T4 endonuclease V . 16
1.2.4 Ứng dụng của enzym T4 endonuclease V . 17
1.3 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP DẠNG THỂ VÙI TRONG TẾ
BÀO VI KHUẨN E.coli 19
1.3.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E.coli 19
1.3.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E.coli 20 Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học


1.3.3 Chủng E.coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong
biểu hiện protein T4 endonuclease V . 20
1.3.3.1 Chủng E.coli BL21(DE3) Star . 20
1.3.3.2 Hệ thống vector pET . 21
1.3.3.3 Cơ chế điều hòa của hệ thống operon lac . 22
1.4 QUY TRÌNH NUÔI CẤY E.coli BIỂU HIỆN PROTEIN
T4 ENDONUCLEASE V 25
2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 26
2.1 VẬT LIỆU . 26
2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 26
2.1.2 Hóa chất . 26
2.1.3 Môi trường 30
2.1.4 Nguyên vật liệu 32
2.2 PHƯƠNG PHÁP . 34
2.2.1 Các phương pháp, thao tác cơ bản trong kỹ thuật sinh học phân tử . 34
2.2.1.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 34
2.2.1.2 Tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS kiềm . 35
2.2.1.3 Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả nạp 36
2.2.1.4 Điện di DNA trên gel agarose . 36
2.2.2 Các phương pháp, kỹ thuật và thao tác cơ bản được sử dụng trong
nuôi cấy vi sinh . 36
2.2.2.1 Chuẩn bị giống, môi trường và hệ thống lên men RITAI . 36
2.2.2.2 Quy trình nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 sinh tổng
hợp protein T4 endonuclease V ở quy mô phòng thí nghiệm . 37
2.2.2.3 Quy trình nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 sinh tổng
hợp protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng α-lactose ở quy mô bán công
nghiệp . . 38
2.2.3 Các phương pháp kiểm tra sự biểu hiện T4 endonuclease V 40
2.2.3.1 Phương pháp điện di SDS – PAGE 40 Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học


2.2.3.2 Phương pháp lai Western – Blot . 41
2.2.4 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện protein
T4 endonuclease V dạng thể vùi . 42
2.2.4.1 Thu nhận gen T4 endonuclease V . 42
2.2.4.2 Tạo plasmid pET 26b(+) mang gen T4 endonuclease V . 43
2.2.4.3 Phân lập dòng E.coli TOP10F’ mang plasmid pET-T4 . 43
2.2.4.4 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện protein
T4 endonuclease V 45
2.2.5 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protein T4 endonuclease V của
chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 bằng chất cảm ứng IPTG trên môi
trường MDG và LB 45
2.2.6 Nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 kiểm tra khả năng biểu
hiện tự động (auto-induction) protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng
α-lactose có trong thành phần môi trường MDG-2 . 46
2.2.7 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4
biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V trên môi trường MDG-2 46
2.2.7.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein
T4 endonuclease V 46
2.2.7.2 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein
T4 endonuclease V 47
2.2.7.3 Khảo sát nồng độ α-lactose ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein
T4 endonuclease V 47
2.2.8 Nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện tự động
protein T4 endonuclease V trên môi trường MDG-2 ở quy mô bán công nghiệp
trong điều kiện tối ưu . 47
2.2.8.1 Nuôi cấy lắc ở quy mô 5 lít trong điều kiện tối ưu . 47
2.2.8.2 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô 10 lít 48
2.2.8.3 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô bán công
nghiệp 150 lít . 49 Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học


2.2.9 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ quy trình thực hiện các thí nghiệm 50
2.2.9.1 Quy trình tạo dòng E.coli biểu hiện protein T4 endonuclease V 50
2.2.9.2 Quy trình lên men thu nhận protein T4 endonuclease V 51
3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN . 52
3.1 TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI BIỂU HIỆN PROTEIN
T4 ENDONUCLEASE V 52
3.1.1 Tạo dòng E.coli TOP10F’ mang plasmid tái tổ hợp pET-T4 52
3.1.2 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện protein
T4 endonuclease V 56
3.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEIN
T4 ENDONUCLEASE V CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 BẰNG
CHẤT CẢM ỨNG IPTG TRÊN MÔI TRƯỜNG MDG và LB . 57
3.2.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-
T4 trên môi trường MDG và LB 58
3.2.2 Đánh giá khả năng biểu hiện protein T4 endonuclease V của chủng
E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 trên môi trường MDG và LB 60
3.3 NUÔI CẤY CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 KIỂM TRA KHẢ
NĂNG BIỂU HIỆN TỰ ĐỘNG PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V BỞI
CHẤT CẢM ỨNG α-LACTOSE CÓ TRONG THÀNH PHẦN MÔI
TRƯỜNG MDG-2 61
3.4 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG E.coli BL21(DE3)
Star/pET-T4 BIỂU HIỆN TỰ ĐỘNG PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V
TRÊN MÔI TRƯỜNG MDG-2 . 64
3.4.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện tự động
protein T4 endonuclease V . 64
3.4.2 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện tự động
protein T4 endonuclease V . 66
3.4.3 Khảo sát nồng độ α-lactose ảnh hưởng đến sự biểu hiện tự động
protein T4 endonuclease V . 67 Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học


3.5 NUÔI CẤY CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 BIỂU HIỆN TỰ
ĐỘNG PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V TRÊN MÔI TRƯỜNG
MDG-2 + 0.4% α-LACTOSE Ở QUY MÔ BÁN CÔNG NGHIỆP 69
3.5.1 Nuôi cấy ở quy mô 5 lít trong điều kiện tối ưu . 69
3.5.2 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô 10 lít trong
điều kiện tối ưu . 71
3.5.3 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô 150 lít
trong điều kiện tối ưu . 74
4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ . 77
4.1 KẾT LUẬN 77
4.2 ĐỀ NGHỊ . 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78