Thạc Sĩ Xây dựng quy trình tạo dòng và lên men thu nhận protein T4 endonuclease V trong hệ thống biểu hiện E

MỞ ĐẦU

Qua nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới phát hiện chỉ có dưới 10% bệnh ung thư phát sinh do các rối loạn từ bên trong cơ thể gồm: các rối loạn nội tiết, tổn thương gen có mang tính di truyền – đây là nguyên nhân nội sinh. Ngược lại, có đến 75% – 80% nguyên nhân phát sinh ung thư có liên quan đến yếu tố môi trường sống hay còn gọi là nguyên nhân ngoại sinh. Ung thư da là một trong những bệnh ung thư có liên quan trực tiếp đến yếu tố môi trường và có mối quan hệ mật thiết với sự suy giảm của tầng ozone. Các nhà nghiên cứu cho thấy khi tầng ozone bị suy giảm
10% có thể dẫn đến việc gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ung thư tế bào hắc tố, ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào vẩy lần lượt là 10%, 20% và 50% [5]. Trên thế giới, ung thư da được xếp vào loại ung thư phổ biến nhất ở một số nước như: Úc, Anh, Mỹ Ở Việt Nam, số bệnh nhân mắc bệnh ung thư da năm 2010 cao gấp 2.4 lần so với năm 2007 và bệnh ung thư da được xếp vào 10 loại ung thư thường gặp. Nguyên nhân chính gây ung thư da do sự tồn tại các phân tử pyrimidine dimer: cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) và (6–4) pyrimidone photoproduct (6–4PP) ở các gen chủ chốt điều khiển quá trình phân bào như gen p53 sẽ dẫn đến quá trình phát sinh bệnh ung thư. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, đột biến gen p53 chiếm 50% trong tổng số nguyên nhân gây ra tất cả các dạng ung thư ở người, đồng thời là nguyên nhân chính gây ung thư da. Đặc biệt, ở những bệnh nhân khô da sắc tố nhạy cảm với tia UV và dễ bị đột biến trong phân tử DNA khi tiếp xúc với tia UV do thiếu cơ chế sửa sai DNA dẫn đến có nguy cơ mắc bệnh ung thư da cao gấp 1000 lần so với nhóm người bình thường. Năm 1975, Tanaka và đồng nghiệp đã chứng minh được protein T4 endonuclease V được mã hóa bởi gen denV của bacteriophage T4 có kích thước khoảng 16 kDa được tách chiết từ E.coli nhiễm thực khuẩn thể T4 có khả năng xúc tác cho bước đầu tiên trong quá trình sửa chữa cắt bỏ chuyên biệt phân tử pyrimidine dimer; protein T4 endonuclease V được bao bọc bởi liposome gọi là T4N5 liposome [8]. T4N5 liposome được ứng dụng trong mỹ phẩm như là một thành phần của kem bôi da có khả năng ngăn ngừa và điều trị bệnh ung thư da. Với nhu cầu cấp thiết ngăn ngừa bệnh ung thư da đang có xu hướng gia tăng do hiện trạng ô nhiễm môi trường trên thế giới và Việt Nam ngày càng tăng đã góp phần nào làm suy giảm tầng ozone, giảm tỷ lệ mắc bệnh cũng như gia tăng độ tuổi mắc bệnh ung thư da cho nhóm người bình thường và các bệnh nhân XP, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình tạo dòng và lên men thu nhận protein T4 endonuclease V trong hệ thống biểu hiện E.coli ở quy mô bán công nghiệp”. Các nội dung thực hiện của luận văn bao gồm:
 Tạo dòng E.coli biểu hiện protein T4 endonuclease V dạng thể vùi.
 Nuôi cấy chủng E.coli sinh tổng hợp protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng IPTG trên môi trường LB và MDG.
 Nuôi cấy chủng E.coli kiểm tra khả năng biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng α-lactose có trong môi trường MDG-2.
 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng E.coli biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng α-lactose có trong môi trường MDG-2 ở quy mô phòng thí nghiệm và áp dụng điều kiện nuôi cấy tối ưu vào quy mô bán công nghiệp.

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT . i
DANH MỤC CÁC BẢNG . iv
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ . v
MỞ ĐẦU . 1
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 UNG THƯ DA . 3
1.1.1 Khái niệm 3
1.1.2 Phân loại 3
1.1.2.1 Ung thư tế bào đáy 3
1.1.2.2 Ung thư tế bào vẩy 4
1.1.2.3 Ung thư tế bào hắc tố 4
1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư da 5
1.1.4 Tác hại của tia UV . 5
1.1.4.1 Hình thành phân tử pyrimidine dimer (PD) 5
1.1.4.2 Cơ chế sửa sai phân tử pyrimidine dimer 7
1.1.5 Tình hình ung thư da trên thế giới và ở Việt Nam 10
1.2 ENZYM T4 ENDONUCLEASE V . 12
1.2.1 Cấu trúc . 12
1.2.2 Quá trình enzym T4 endonuclease V nhận biết chuyên biệt PD . 14
1.2.2.1 Enzym trượt không đặc hiệu trên phân tử DNA chứa PD 14
1.2.2.2 Enzym dừng lại tại vị trí PD . 14
1.2.2.3 Enzym nhận biết chuyên biệt với PD . 15
1.2.3 Hoạt tính xúc tác của enzym T4 endonuclease V . 16
1.2.4 Ứng dụng của enzym T4 endonuclease V . 17
1.3 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP DẠNG THỂ VÙI TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli 19
1.3.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E.coli 19
1.3.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E.coli 20
1.3.3 Chủng E.coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu hiện protein T4 endonuclease V . 20
1.3.3.1 Chủng E.coli BL21(DE3) Star . 20
1.3.3.2 Hệ thống vector pET . 21
1.3.3.3 Cơ chế điều hòa của hệ thống operon lac . 22
1.4 QUY TRÌNH NUÔI CẤY E.coli BIỂU HIỆN PROTEIN
T4 ENDONUCLEASE V 25
2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 26
2.1 VẬT LIỆU . 26
2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 26
2.1.2 Hóa chất . 26
2.1.3 Môi trường 30
2.1.4 Nguyên vật liệu 32
2.2 PHƯƠNG PHÁP . 34
2.2.1 Các phương pháp, thao tác cơ bản trong kỹ thuật sinh học phân tử . 34
2.2.1.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 34
2.2.1.2 Tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS kiềm . 35
2.2.1.3 Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả nạp 36
2.2.1.4 Điện di DNA trên gel agarose . 36
2.2.2 Các phương pháp, kỹ thuật và thao tác cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh . 36
2.2.2.1 Chuẩn bị giống, môi trường và hệ thống lên men RITAI . 36
2.2.2.2 Quy trình nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 sinh tổng hợp protein T4 endonuclease V ở quy mô phòng thí nghiệm . 37
2.2.2.3 Quy trình nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 sinh tổng hợp protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng α-lactose ở quy mô bán công nghiệp . . 38
2.2.3 Các phương pháp kiểm tra sự biểu hiện T4 endonuclease V 40
2.2.3.1 Phương pháp điện di SDS – PAGE 40
Mục lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2.2.3.2 Phương pháp lai Western – Blot . 41
2.2.4 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện protein T4 endonuclease V dạng thể vùi . 42
2.2.4.1 Thu nhận gen T4 endonuclease V . 42
2.2.4.2 Tạo plasmid pET 26b(+) mang gen T4 endonuclease V . 43
2.2.4.3 Phân lập dòng E.coli TOP10F’ mang plasmid pET-T4 . 43
2.2.4.4 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện protein T4 endonuclease V 45
2.2.5 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protein T4 endonuclease V của chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 bằng chất cảm ứng IPTG trên môi trường MDG và LB 45
2.2.6 Nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 kiểm tra khả năng biểu hiện tự động (auto-induction) protein T4 endonuclease V bởi chất cảm ứng α-lactose có trong thành phần môi trường MDG-2 . 46
2.2.7 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V trên môi trường MDG-2 46
2.2.7.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein T4 endonuclease V 46
2.2.7.2 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein T4 endonuclease V 47
2.2.7.3 Khảo sát nồng độ α-lactose ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein T4 endonuclease V 47
2.2.8 Nuôi cấy chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V trên môi trường MDG-2 ở quy mô bán công nghiệp trong điều kiện tối ưu . 47
2.2.8.1 Nuôi cấy lắc ở quy mô 5 lít trong điều kiện tối ưu . 47
2.2.8.2 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô 10 lít 48
2.2.8.3 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô bán công nghiệp 150 lít . 49
2.2.9 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ quy trình thực hiện các thí nghiệm 50
2.2.9.1 Quy trình tạo dòng E.coli biểu hiện protein T4 endonuclease V 50
2.2.9.2 Quy trình lên men thu nhận protein T4 endonuclease V 51
3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN . 52
3.1 TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI BIỂU HIỆN PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V 52
3.1.1 Tạo dòng E.coli TOP10F’ mang plasmid tái tổ hợp pET-T4 52
3.1.2 Tạo dòng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 biểu hiện protein T4 endonuclease V 56
3.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 BẰNG CHẤT CẢM ỨNG IPTG TRÊN MÔI TRƯỜNG MDG và LB . 57
3.2.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E.coli BL21(DE3) Star/pETT4 trên môi trường MDG và LB 58
3.2.2 Đánh giá khả năng biểu hiện protein T4 endonuclease V của chủng E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 trên môi trường MDG và LB 60
3.3 NUÔI CẤY CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 KIỂM TRA KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN TỰ ĐỘNG PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V BỞI CHẤT CẢM ỨNG α-LACTOSE CÓ TRONG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MDG-2 61
3.4 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 BIỂU HIỆN TỰ ĐỘNG PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V TRÊN MÔI TRƯỜNG MDG-2 . 64
3.4.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V . 64
3.4.2 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến sự biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V . 66
3.4.3 Khảo sát nồng độ α-lactose ảnh hưởng đến sự biểu hiện tự động protein T4 endonuclease V . 67
3.5 NUÔI CẤY CHỦNG E.coli BL21(DE3) Star/pET-T4 BIỂU HIỆN TỰ ĐỘNG PROTEIN T4 ENDONUCLEASE V TRÊN MÔI TRƯỜNG MDG-2 + 0.4% α-LACTOSE Ở QUY MÔ BÁN CÔNG NGHIỆP 69
3.5.1 Nuôi cấy ở quy mô 5 lít trong điều kiện tối ưu . 69
3.5.2 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô 10 lít trong điều kiện tối ưu . 71
3.5.3 Nuôi cấy bằng hệ thống lên men tự động RITAI ở quy mô 150 lít trong điều kiện tối ưu . 74
4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ . 77
4.1 KẾT LUẬN 77
4.2 ĐỀ NGHỊ . 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78