Luận Văn Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể

Đồ án tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể


MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT . i
DANH MỤC CÁC BẢNG . ii
DANH MỤC CÁCHÌNH iii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN 3
1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY 4
1.1. Sơ lược về ăn chay 4
1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước . 4
2. TỔNG QUAN VỀ HỆ GEN TY THỂ 5
2.1. Cấu trúc hệ gen ty thể . 5
2.2. Gen 16S rRNA trongphát hiện thịt động vật . 8
3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG
THỰC PHẨM 10
3.1. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein 10
3.1.1. Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di 11
3.1.2. Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 11
3.2. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA . 12
3.2.1. Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization) . 12
3.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 13
3.2.3. Phương pháp Real time PCR 15
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17
1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ . 18
1.1. Vật liệu-hóa chất 18
1.1.1. Mẫu thực phẩm 18
1.1.2. Mồi . 18
1.1.3. Hóa chất. 18
1.2. Dụng cụ thiết bị . 19
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Phương pháp xử lý mẫu . 20
2.2. Phương pháp tách chiết DNA 20
2.2.1. Nguyên tắc . 20
2.2.2. Tiến hành 21
2.3 .Tiến hành phản ứng PCR . 21
2.3.1. Thành phần . 21
2.3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng 21
2.3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm . 22
2.4. Điện di trên gel agarose 23
2.4.1. Nguyên tắc . 23
2.4.2. Pha hóa chất . 23
2.4.3. Tiến hành 23
2.5. Phương pháp thiết kế mồi. . 23
2.5.1. Tiêu chuẩn thiết kế mồi 23
2.5.2. Các phần mềm sử dụng . 24
2.5.3. Phương pháp tiến hành 24
2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lí thuyết 25
2.7. Phương pháp đánh giá mồi trên thực nghiệm . 25
2.7.1. Phương pháp đánh giá khả năng hoạt động của mồi . 25
2.7.2. Phương pháp khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi . 25
2.7.3. Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi . 25
2.7.4. Phương pháp khảo sát độ nhạy của phản ứng 26
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27
1. THIẾT KẾ MỒI 28
2. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỒI TRÊN LÝ THUYẾT . 28
2.1. Khảo sát kích thước, %GC, nhiệt độ nóng chảy (T
m
). . 28
2.2. Khảo sát cấu trúc thứ cấp của mồi . 29
2.3. Khảo sát tính đặc hiệu và sự nhân bản chọn lọc của mồi theo lý thuyết . 31
3. KHẢO SÁT MỒI TRÊN THỰC NGHIỆM . 35
3.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi 35
3.2. Kết quả giải trình tự 36
3.3. Khảo sát nhiệt độ lai . 39
3.4. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40
3.5. Khảo sát độ nhạy của quy trình . 41
4. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU THỰC PHẨM CHAY 42
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
1 KẾT LUẬN . 45
2 KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 46


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thế giới ẩm thực là vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt phải kể đến là thực
phẩm dành cho những người ăn chay. Khoa học cũng đã chứng minh, ăn chay là m ột
hình thức ăn uống có lợi cho sức khỏe nhưgiúpgiảm cân, giảm huyết áp, giảm bệnh
động mạch vành tim, giảm nguy cơ bị sỏi thận,bị ung thư, giảm triệu chứng bệnh về
xương và khớp Do đó, xu hướng ăn chay ngày càng được nhiều người tiêu dùng có
xu thế sử dụng.
Trên thị trường thực phẩm chay, hàng hoá rất đa dạng từ thực phẩm khô đến hàng
đóng hộp, ăn liền, chế biến sẵn với giá thành cao hơn nhiều so với những sản phẩm
mặn thông thường. Thế nhưng, mức độ đáp ứng “đúng” tiêu chí của một loại thực
phẩm ăn chay theo nghĩa: nguyên liệu dùng để sản xuất phải có nguồn gốc từ thực vật.
Hiện tại, chỉ có một vài cơ sở lớn, chuyên s ản xuất và kinh doanh thực phẩm chay như
Âu Lạc, Kim Chi có ghi rõ đầy đủ thành phầnnguyên liệutrên sản phẩm, trong khi đó
sản phẩm của các cơ sởchế biến nhỏ, lẻ lại chưa được kiểm soátvà rất thiếu thông tin
về thành phần nguyên liệu
[30]
.
Một số nghiên cứu mới đây cho thấy những thành phần hương liệu mà các nhà
sản xuất đưa vào sản xuất thực phẩm chay có chứa thịt hoặc nước xương hầm thịt vì
vậykhiến cho những người ăn chay vô tình phá giớivà làm cho thực phẩm ăn chay
chưa đúng với tên gọi của nó.Vấn đề đặt ra là làm sao để xác định được thành phần
của sản phẩm chay có chứa thịt động vật hay hay không là một yêu cầu bức thiết.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, một số nhà khoa học đã đưa ra một số
phương pháp để nhận biết các loại thịt và xác định nguồn gốc của thịt nhưng vẫn chưa
được các cấp quản lý thực phẩm quan tâm nhiều. Các phương pháp phát hiện thịt chủ
yếu là dựa vào phát hiệntrình tựgenty thể để phát hiện loài. Bởi DNA ty thể có nhiều
ưu điểm thích hợp làm đối tượng nghiên cứunhư: DNA ty thể có đặc điểm đơn bội,
không táitổ hợp, di truyền theo dòng mẹ;Số lượngbản sao lớn trong mỗi tế bào; trong
khi tách chiết, DNA ty thểbền vững hơn DNA nhân do có cấu trúc dạng vòng, khó bị
phá vỡvà dễ dàng tách chiết hơn
[2]
. Đặc biệt, gen 16S ty thể là trình tự có những vùng
2
bảo tồn ở hầu hết các loài động vật nên có thể dựa vào đặc điểm này để xây dựngquy
trình phát hiện DNA của động vật khichúng có mặt trong thực phẩm chay.
Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện thịt
trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể”.
Mục đích của đồ án: đánh giá chính xác và nhận biết nhanh chóng sự có mặt của
thịt trong các sản phẩm chay.
Nội dung:
1) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR.
2) Khảo sát các đặc tính của mồi đã thiết kế về mặt lý thuyết.
3) Khảo sát khả năng hoạt động của mồi khi thực hiện phản ứng PCR.
4) Thử nghiệm phát hiện thịttrong thực phẩm chay bằng phản ứng PCR gen 16S
ty thể.
Về phương diện khoa học, đây là quy trình mới có thể nhận biết được sự có mặt
của DNA các loài động vật nói chung. Về mặt thực tiễn, phương pháp sẽ giúp cơ quan
quản lý chất lượng thực phẩm kiểm soát được các mặt hàng thực phẩm chay trên thị
trường, giúp người tiêu dùng an tâm hơn khi sử dụng các sản phẩm chay.


PHẦN I.
TỔNG QUAN
4
1.TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chay
Thực phẩm chay là thực phẩm không chứa các thành phần động vật và những
chất có nguồn gốc động vật.
Thực phẩm chay giả mặn là những thực phẩm được chế biến chủ yếu từ tinh bột
được tạo hình mô phỏng thành các món ăn mặn nhưtôm, mực, thịt heo, bò, cá .
Thuật ngữ “ăn chay” được biết đến ở đạo Phật và một vài tôn giáokhác. Ngày
nay, ăn chay đang trở thành một trào lưu trên thế giới, nhất là trong giới tri thức và các
chuyên gia. Ở các nước phương Tây, theo thống kê chưa đầy đủ, có khoảng 5% dân số
Anh và Mỹ cho biết họ ăn chay trường hay ăn chay thường xuyên
[26]
. Rấtnhiều nghiên
cứu khoa học trong hơn 20 năm qua đã cho thấy ăn chay còn được xem như một liệu
pháp để giảm bớt nguy cơ xảy ra nhiều loại bệnh tật nguy hiểm như tim mạch, cao
huyết áp, đái tháo đường, ung thư, . Trong một nghiên cứu trên 47.000 người Mỹ cho
thấy nhóm người ăn chay có nguy cơ mắc bệnh tim mạch thấp hơn nhóm ăn mặn
khoảng 20%. Ăn chay và ăn nhiều rau quả còn giảm nguy cơ tai biến mạch máu não
đến 22%. Ngoài ra, ăn chay còn giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú, ruột và phổi so
với ăn mặn. Một nghiên cứu khác trên 26.000 người Mỹ cho thấy người ăn chay có tỉ
lệ mắc bệnh đái tháo đường thấp hơn người ăn mặn khoảng 25%
[28]
. Hơn nữa,ăn chay
được xem như một biện pháp bảo vệ môi trường. Do đó, nhu cầu về thực phẩm chay
trên thị trường hiện nay là rất lớn.
1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước.
Cơ quan tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm (FDA) tại Đài Bắc đã khám phá ra rằng
15 loại trong 21 loại thực phẩm chay giả thịt lấy từ các khu chợ có chứa DNA động
vật, chiếm hơn 70%.
[30]
Theo các nghiên cứu này, DNA của các loài động vật thường
được phát hiện trong thực phẩm chay như: động vật nuôi có sừng (trâu, bò, ), gia cầm
(gà, vịt, đà điểu, ), heo và cá. Ngày 1 tháng 7 năm 2009, Đài Loan đã ban hành các
đạo luật về việc dán nhãn các thực phẩm chay với mục đích đảm bảo các thực phẩm
5
này là chay
[31]
. Như vậy, trên thế giới, số sản phẩm chay bị nhiễm thịt tăng cao đến
mức báo động.
Ở Việt Nam, các sản phẩm chay giả mặn đang ngày càng thịnh hành trên thị
trường từ các siêu thị, nhà hàng, quán ăn cho đến các chợ, quán tạp hoá lớn nhỏ trên
khắp cả nước như: thịt bò chay, thịt heo chay, sườn non chay, bóng cá chay, tôm chay,
cánh gà chay, đùi gà chay, cá thu chay, mực chay Giáthành của các sản phẩm chay
giả mặn thường cao hơn so với các sản phẩm mặn. Theo khảo sát thị trường giá một số
loại như sau: tôm chay 120.000đ/kg, mực chay cắt lát 50.000đ/kg, cá viên chay
30.000đ/kg, Sườn non chay: 65.000 đồng/kg, Chả lụa chay: 13.000 đồng/cây 400gr,
Chà bông chay các loại: 112.000 đồng/kg, Thịt gà xé /bò xé kim chi: 8.000 đồng/gói
50gr, Bò viên/cá viên chay: 10.500 đồng/gói 180gr
Thị trường thực phẩm chay tại các chợ lớn tại thành phố Hồ Chí Minh như chợ
An Đông, Bình Tây, Bến Thành rất đáng ngờ vì các sản phẩm chủ yếu được nhập từ
Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc không ghi rõ thành phần, nguồn gốc, hạn sử dụng
nhưng được bày bán rất phổ biến. Ngoài ra còn có những sản phẩm chay nội địa được
sản xuất tại các cơ sở nhỏ lẻ tại địa phương với hình dáng và mùi vị rất giống với món
mặn
[32]
.
Vấn đề thực phẩm chay bị nhiễm thịt đang được nhiều người quan tâm nên việc
tìm ra phương pháp để phát hiện thịt trong thực phẩm chay là rất cần thiết.
2.GIỚI THIỆU VỀ HỆ GEN TY THỂ
2.1. Cấu trúccủa hệgen ty thể
[2,4,6,7,12,13,16]
 Đặc điểm cấu trúc ty thể
Ty thể được Altmann mô tả lần đầuvào năm 1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi
của ty thể đã được nghiên cứu chi tiết bởi Palade (1952) và Sjostrand (1953)
[7]
.
Ty thể là bào quan có hình tròn hoặc hình tr ụ dài, kích thước 2-5 µm. Toàn bộ
cấu trúc ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng. Lớp màng ngoài bao trùm tạo nên ranh
giới ngoài của ty thể, lớp màng trong tạo thành nếp gấp hướng vào tâm là nơi khu trú


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. HồHuỳnh Thùy Dương(2005), sinh học phân tử,nhà xuất bảnGiáo Dục .
2. Lê Tiến(2009), Nghiên cứu đa hình trình tựvùng điều khiển (D-LOOP) hệ
gen ty thểcủa gà ri, gà đông tảo và gà tre, Luận văn thạc sỹsinh học, Đại học sư phạm
Thái Nguyên, Thái Nguyên.
3. Nguyễn Văn Thanh(2007), sinh học phân tử.
4. Nguyễn Như Hiền-Trịnh Xuân Hậu, 2000, Tếbào học, nhà xuất bản ĐHQG
Hà Nội
5. TS. BS. Phạm Hùng Vân, PCR và Real-time PCR, các vấn đềcơ bản và các
áp dụng thường gặp, NXB Y học.
TIẾNG ANH
6. Chinnery P.F., Schon E.A. (2003), “Mitochondria”, J Neurol Neurosurg
Psychiatry, 74, pp.1188-1199.
7. Ernster L., Schatz G. (1981), Mitochondria: A historical review, J Cell Biol,
91(3), pp.227-255.
8. Fur-Chi Chen and Y-H. Peggy Hsieh, (2000), Detection of Pork in HeatProcessed Meat Products by Monoclonal Antibody-Based ELISA, Journal of AOAC
International vol. 83, no.
9. Gordon Wiseman, Mr Peter Bowler, Ms Katrina Ohara, (2003), Evaluation of
quantitative real-time PCR (QRT-PCR) to determine the presence of meat species in
processed vegetarian foods, RHM Technology Ltd.
10. Gregory C. Booton, Jennifer R. Carmichael, Govinda S. Visvesvara, Thomas
J. Byers, and Paul A. Fuerst, (2003), Identification of Balamuthia mandrillaris by PCR
Assay Using the Mitochondrial 16S rRNA Gene as a Target, Journal of Clinical
Microbiology, Jan. 2003, p. 453–455.
11. Hsing-Mei Hsieh, Ph.D.; Chin-Cheng Tsai, M.S.; Li-ChinTsai, M.S.; HsiaoLing Chiang, (2005), Species identification of meat products using the cytochrome b
gene, Forensic Science Journal 2005;4:29-36.
48
12. Hurng-Yi Wang, Mung-Pei Tsai, Ming-Chung Tu and Sin-Che Lee, (2000),
Universal Primers for Amplification of the Complete Mitochondrial 12S rRNA Gene in
Vertebrates, Zoological Studies 39(1).
13. Jeffrey L. Boore, (1999), Survey and summaryAnimal mitochondrial
genomes, Department of Biology, University of Michigan, 830 North University
Avenue, Ann Arbor, MI 48109-1048, USA.
14. Magdalena Montowska, Edward Pospiech, (2007), Species identification of
meat by electrophoretic methods, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment.
15. M. Natonek, E. Słota, A. Żyga and B. Rejduch, (2004), The utilization of
methods based on protein and DNA analysis for identification of animal-origin
components in feeds, Journal of Animal and Feed Sciences.
16. M. Unseld, B Beyermann, P Brandt, et al, (1995), Identification of the species
origin of highly processed meat products by mitochondrial DNA sequences, 1995 4:
241-243 Genome Res.
17. Nicolai Z. Ballin, Finn K. Vogensen, Anders H. Karlsson, (2009), Review:
Species determination –Can we detect and quantify meat adulteration?, Meat Science.
18. O. Irfan ILHA, Ali ARSLAN,(2007), Identification of Meat Species by
Polymerase Chain Reaction (PCR)Technique, Turk, J. Vet. Anim. Sci.
19. P.S. Girish, A.S.R. Anjaneyulu, K.N. Viswas, M. Anand, N. Rajkumar, B.M.
Shivakumar, Sharma Bhaskar, (2004), Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA
gene can identify meat species, Meat Science 66, 551-556.
20. Scott Reaney, Trevor Conrad Martin, Jason Paul Sawyer, (2009), Detection
assay for meat and bone meal in feed, United States Patent application publication US
2009/0170107A1.
21. Shally Jain, M N Brahmbhait, D N Rank, C G Joshi and J V Solank, (2007),
Use of cytochrome b gene variability in detecting meat species by multiplex PCR
assay, Indian Journal of Animal Sciences 77 (9): 880-881.
22. Terry Melton, Ph.D. and Charity Holland, M.P.H., (2007), Routine Forensic
Use of the Mitochondrial 12S Ribosomal RNA Gene for Species Identification, J
Forensic Sci.
49
23. Uganda Joseph Wadege, George W. Nasinyama, Erastus K.
Kang’ethe.William Olaho Mukani, (2006), Adulteration of beef sausages with pork
sold in supermarkets in Kampala, Afr. J. Anim. Biomed. Sci.
24. United States Department of Agriculture Food Safety And Inspection Service,
Office of Public Health and Science, (2003),Laboratory Guidebook Notice of Change.
25. Yun-Chieh huang, Tai-Yuan Chen, Sen-ShYong Jeng, hong-Ming Chen and
deng-Fwu hwang, (2010), Species Identification of a Causative Moray Eel Meat by
SDS-PAGE, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 4, 2010, Pages 232-238.
TÀI LIỆU INTERNET
26. www.godsdirectcontact.org/ ./Vegan_Criteria%20Aulacese%20V3A.pdf
27. http://anchay.com.vn/thuc_pham_chay_chi_tiet.aspx?id=78
28. http://nonglamsuctayninh.com/bai-viet/suu-tam/290 -an-chay-nhu-la-mot-trilieu-html
29. http://www.dharmasite.net/LuuYVeThucPhamChayGiaMan.htm
30. http://www.taiwannews.com.tw/etn/news_content.php?id=978909&cate_img
=logo_bilingualnews&cate_rss=news_bilingual
31. http://www.chinapost.com.tw/taiwan/national/nationalnews/2009/12/08/2356
00/Veggiemeatballs.htm
32. http://www.nhantrachoc.net.vn/forum/archive/index.php?t-3040.html