Thạc Sĩ Xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm a trên tế bào mdck bằng hệ thống vi hạt

Đặt vấn đề
Từ năm 1995, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã khuyến nghị sử dụng tế bào động vật thay thế dần trứng gà trong nuôi cấy virus cúm nhằm tạo ra được một lượng sinh khối lớn virus đảm bảo chất lượng với thời gian sản xuất ngắn nhất và giá thành hợp lý hơn. Trong số các dòng tế bào thường trực đã được kiểm tra, đánh giá thì MDCK (tế bào thận chó), Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) và PER.C6 (tế bào võng mạc phôi người) là 3 dòng tế bào đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn để có thể được dùng trong sản xuất virus cúm. Ngày nay, công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào MDCK đang được triển khai nghiên cứu ở nhiều quốc gia và được các hãng dược phẩm, hóa chất uy tín trên thế giới sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học, chẩn đoán dựa trên những ưu điểm vượt trội của tế bào MDCK và các hệ thống nuôi cấy với giá thể vi hạt (microcarrier). Với hệ thống vi hạt, việc nuôi cấy tế bào/virus không những có thể được tiến hành ở quy mô hàng ngàn lít mà nó còn cho phép kiểm tra toàn diện và tự động hóa nhiều khâu trong quy trình sản xuất nên góp phần nâng cao chất lượng của sản phẩm tế bào/virus được nuôi cấy. Tuy nhiên, so với hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào trong các bình lên men, công nghệ nuôi cấy tế bào/virus bằng hệ thống vi hạt hiện vẫn là 1 kỹ thuật còn khá mới mẻ ở Việt Nam và cũng chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm.
Các trận dịch cúm dường như luôn xảy ra trong suốt lịch sử loài người. Trong thế kỷ 20, thế giới đã có 3 thảm họa cúm (1918 – 1929; 1957 – 1958; 1968 – 1969) làm thiệt mạng hàng triệu người. Vào tháng 04/2009, dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21 do virus cúm A(H1N1) mới 2009 đã xuất phát từ Mexico, và chỉ sau 2 tháng, WHO đã công bố đại dịch mức 6 khi virus cúm H1N1/2009 đã lan rộng toàn cầu. Tính đến ngày 06/08/2010, đã có trên 214 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận có trường hợp nhiễm virus cúm H1N1/2009 với số ca mắc lên đến hàng trăm ngàn người và 18449 người tử vong. Theo báo cáo của Bộ Y tế, đến ngày 20/03/2010, Việt Nam đã xác định được 11202 trường hợp dương tính với virus cúm A(H1N1) mới 2009 tại 60/64 tỉnh, thành phố, và bệnh nhân tử vong gần đây nhất vào tháng 08/2010 đã nâng tổng số trường hợp tử vong của cả nước lên 60 người. Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm A(H1N1) chủng NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt sử dụng tế bào MDCK và vi hạt Cytodex1.

Vì virus NIBRG-121xp-E1 là 1 chủng virus mới với các khảo sát ban đầu cho thấy chủng virus này nhân lên rất yếu ngay cả trên trứng gà, và hệ thống vi hạt là 1 phương pháp nuôi cấy mới; do đó, chúng tôi lần lượt tiến hành các thí nghiệm cơ bản nhằm chuẩn hóa lại từng điều kiện nuôi cấy cho tế bào MDCK và chủng virus NIBRG-121xp-E1. Điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng vì đây là cơ sở để có thể đưa quy trình nuôi cấy này từ quy mô phòng thí nghiệm ra sản xuất lớn.

Mục tiêu của đề tài

ã Chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK nhằm nâng số lượng tế bào lên tối đa.
ã Thích ứng và chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG-121xp- E1 trên tế bào MDCK.
ã Áp dụng các điều kiện đã chuẩn hóa để nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt Cytodex1.
ã Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu

ã Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 12/2009 đến tháng 8/2010.
ã Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur TpHCM.
Mục lục

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục . i
Danh mục chữ viết tắt . iv
Danh mục bảng v
Danh mục hình ảnh . vi
Đặt vấn đề . viii
Phần 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1
1.1.1. Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1
1.1.2. Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất virus . 3
1.2. Tế bào MDCK . 6
1.2.1. Định nghĩa 6
1.2.2. Lịch sử phát triển dòng tế bào MDCK . 6
1.2.3. Một số ứng dụng của tế bào MDCK . 6
1.2.4. Ưu điểm của tế bào MDCK . 7
1.2.5. Đặc điểm của tế bào MDCK 8
1.2.5.1. Đặc điểm hình thái 8
1.2.5.2. Đặc điểm di truyền 8
1.2.5.3. Đặc điểm sinh lý 8
1.2.6. Điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK 9
1.3. Virus cúm A(H1N1) mới 2009 . 10
1.3.1. Sơ lược về virus cúm A 10
1.3.2. Virus cúm A(H1N1) mới 2009 12
1.3.2.1. Các đặc điểm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 12
1.3.2.2. Tình hình dịch cúm A(H1N1) mới 2009 trên thế giới và tại Việt Nam 17
Phần 2. Vật liệu – Phương pháp
2.1. Vật liệu 20
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm . 20
2.1.1.1. Hóa chất 20
2.1.1.2. Sinh phẩm 22
2.1.2. Dụng cụ 23
2.1.3. Thiết bị . 24
2.2. Phương pháp . 25
2.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của mycoplasma trong dịch nuôi cấy tế bào 25
2.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào . 25
2.2.3. Nuôi cấy tế bào và virus trên vi hạt Cytodex1 . 27
2.2.4. Định kiểu nhân (karyotyping) 29
2.2.5. Xác định hiệu giá virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu 31
2.2.6. Xác định hiệu giá virus bằng TCID50 theo Reed – Muench (1938) . 32
2.2.7. Xác định liều gây nhiễm MOI 34
Phần 3. Kết quả và biện luận
3.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643 [5% CO2, 10%FBS] . 36
3.2. So sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK trong các môi trường khi thay đổi
nồng độ FBS và CO2 40
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào MDCK 44
3.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho virus NIBRG-121xp-E1 . 48
3.5. Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1 . 55
3.6. Khảo sát thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1
. 61
3.7. Ứng dụng các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã được khảo sát để nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 . 65
3.8. Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 68
Phần 4. Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận 75
4.1.1. Các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 . 75
4.1.2. Các điều kiện nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 75
4.1.3. Sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 76
4.1.4. Quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt. 76
4.2. Đề nghị 77
Các công trình đã công bố 78
Tài liệu tham khảo . 79
Phụ lục . 87