Luận Văn Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyt

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Tình hình dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra 2
1.1.1. Trên thế giới 2
1.1.2. Ở Việt Nam 5
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio và Vibrio parahaemolyticus 6
1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio 6
1.2.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 10
1.2.3. Gen độc tố của Vibrio parahaemolyticus 12
1.2.4. Khả năng gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus 14
1.2.4.1. Nguồn lây nhiễm 14
1.2.4.2. Cơ chế gây bệnh 15
1.2.4.3. Đặc điểm của bệnh 16
1.2.5. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus 18
1.3. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 19
1.3.1. Tính cấp thiết của đề tài 19
1.3.2. Mục tiêu của đề tài 20
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu 21
2.1.1. Mẫu 21
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 21
2.1.3. Hóa chất 22
iii
2.1.3.1. Hóa chất 22
2.1.3.2. Môi trường và thuốc thử 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 27
2.3.1. Phân lập vi khuẩn 27
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 30
2.3.3. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 31
2.3.4. Bảo quản chủng vi khuẩn. 33
2.3.5. Tách chiết DNA tổng số 33
2.3.6. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR 35
2.3.7. Điện di gel agarose 40
2.3.8. Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 41
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Vibrio từ hải sản 44
3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 48
3.3. Một số đặc tính sinh hóa của Vibrio 49
3.4. Tách chiết DNA tổng số 53
3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen toxR 54
3.6. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tlh 55
3.7. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tdh 56
3.8. Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
iv
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT
FDA Food and Drug Administration
CDC Centers of Disease Control
bp Base pair
dNTPs Deoxynucleotide triphosphates
DNA Deoxyribonucleotide Acid
PCR Polymerase Chain Reaction
TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose
tdh (TDH) Thermostable direct hemolysin
trh (TRH) Tdh-related hemolysin
tlh (TLH) Thermolabile hemolysin
Vp-toxRS V. parahaemolyticus toxRS
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
LAMP Loop mediated isothermal amplification
RT- PCR Reverse Transcription PCR
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
OD Optical Density
T3SS Type III Secretion System
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm Vibrio parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm 4
Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus do tiêu thụ thực
phẩm hải sản 1993 - 2000 ở Hồng Kông 5
Bảng 1.3. Đặc điểm của các loài Vibrio gây bệnh trên người liên quan đến việc tiêu
thụ hải sản . 9
Bảng 1.4. Các kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus . 11
Bảng 1.5. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus 18
Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua tại các chợ ở thành phố Nha Trang dùng để
phân lập vi khuẩn Vibrio 21
Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR . 37
Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR toxR 38
Bảng 2.4. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR tlh, tdh 39
Bảng 2.5. Khảo sát tỉ lệ mồi . 43
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được 45
Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio . 49
Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn Vibrio . 51
Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 52
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo Vibrio dưới kính hiển vi điện tử 6
Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu . 27
Hình 2.2. Quy trình phân lập Vibrio parahaemolyticus . 29
Hình 3.1. Các chủng vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường LB 3%
NaCl ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37
o
C 45
Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng T5, T11, T16, T20 sau 24 giờ nuôi cấy trên
môi trường TCBS ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37
o
C . 48
Hình 3.3. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio T11 sau khi nhuộm Gram 49
Hình 3.4. Thí nghiệm lên men đường của chủng vi khuẩn T5 . 51
Hình 3.5. Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio 52
Hình 3.6. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được điện di và soi dưới tia UV
. 53
Hình 3.7. Sản phẩm khuếch đại gen toxR được điện di và soi dưới tia UV 54
Hình 3.8. Sản phẩm khuếch đại gen tlh được điện di và soi dưới tia UV . 55
Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen tdh được điện di và soi dưới tia UV 56
Hình 3.10. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai 57
Hình 3.11. Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi 58
1
LỜI NÓI ĐẦU
Hải sản là một trong những thực phẩm giàu chất dinh dưỡng và thường
không thể thiếu được trong các khẩu phần ăn khoa học. Tuy nhiên, việc tiêu thụ hải
sản có thể dẫn đến những nguy cơ về sức khỏe, bị nhiễm các mầm bệnh sống tự
nhiên trong môi trường nước biển và trong hải sản.
Nguy cơ nhiễm bệnh càng tăng nếu hải sản được xử lý không đúng cách
trong quá trình chế biến, dẫn đến các mầm bệnh có thể phát triể n nhanh chóng theo
cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi.
Một trong những mầm bệnh quan trọng xâm nhiễm vào hải sản là các vi
khuẩn Vibrio, đặc biệt là vi khuẩn V. parahaemolyticus tác nhân gây ra nhiều vụ
ngộ độc thực phẩm do tiêu thụ hải sản trên thế giới. Ngoài các bệnh nhiễm trùng ở
người, một số loài Vibrio còn gây bệnh cho các động vật hải sản dưới nước, trong
đó có các loài cá và tôm có giá trị kinh tế cao.
Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh là một trong những hướng nghiên cứu cần quan tâm.
Đề tài “Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen
độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh” được tiến hành với các
mục tiêu sau:
Phân lập chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái và hóa sinh đặc trưng cho
Vibrio parahaemolyticus.
Tách chiết DNA tổng số và khuếch đại các đoạn gen toxR, tlh, tdh bằng kỹ
thuật PCR.
Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 3 gen độc tố (toxR, tdh, tlh) của vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng kỹ thuật Multiplex PCR.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra
1.1.1. Trên thế giới
Vibrio xâm nhiễm trực tiếp vào hải sản và coi chúng như một phần môi
trường sống của mình. Nhiễm độc thực phẩm do tiêu thụ h ải sản gây ra bởi Vibrio
xảy ra phổ biến mà nguyên nhân chính là do V. parahaemolyticus, chiếm khoảng
25% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do Vibrio gây ra (Feldhusen, 2000).
V. parahaemolyticus sống trên các sinh vật nổi, lơ lửng, động vật phù du, cá
và động vật hai mảnh vỏ (Kaneko và Colwell, 1973). Vi khuẩn này được xác định là
tác nhân gây ra bệnh viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới, đặc biệt là các vùng có
mức tiêu thụ hải sản cao như Đông Nam Á (Joseph và cộng sự, 1982). Năm 1997,
một ổ dịch lớn do V. parahaemolyticus gây ra do tiêu thụ hàu xảy ra dọc theo bờ
biển Thái Bình Dương (CDC, 1998).
Một số nước ở Châu Á cũng xảy ra nhiều ổ dịch như: ở Thái Lan các vụ ngộ
độc do V. parahaemolyticus chiếm hơn một nửa các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra
hàng năm (Leon và cộng sự, 2003), Trung Quốc (31,1% vụ ngộ độc thực phẩm được
báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20 - 30% các trường hợp từ 1981
đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm 1981 và 2003).
Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha (1989, 1999, 2004),
Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng sự, 2005).
Ở Đài Loan, từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng V. parahaemolyticus đã
được thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trường hợp tiêu
chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh. Năm kiểu huyết thanh thường
gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%). Đa số
chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000).
Tại Hồng Kông, V. parahaemolyticus đang là tác nhân gây bệnh hàng đầu
trong số tất cả các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây. Theo số liệu
3
được cung cấp bởi DH (Department of Health), từ năm 1999 đến năm 2003 đã bùng
phát 552 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó chiếm đến 331 (56,7%) vụ là do tiêu thụ
hải sản.
Trước năm 1994, ở Nhật bản tỷ lệ mắc bệnh do V. parahaemolyticus được
công bố còn ít. Thời kì 1994-1995 đã có 1280 vụ về nhiễm bệnh do V.
parahaemolyticus được báo cáo, còn nhiều hơn các vụ ngộ độc thực phẩm do
Salmonella. Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy ra trong mùa hè, số lượng ca ngộ
độc xuất hiện nhiều nhất trong tháng tám. Từ 1996 - 1998, đã có 496 ổ dịch, với
24.373 trường hợp do V. parahaemolyticus gây ra. Số lượng các trường hợp ngộ độc
thực phẩm V. parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997
(Yamazaki và cộng sự, 2000).
Ở Ấn Độ, từ năm 1994 - 1996, có 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi khuẩn V.
parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997). Tỷ lệ mắc tiêu chảy do chủng huyết
thanh O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở Calcutta giữa tháng 9
năm 1996 và tháng 4 năm 1997.
Ở Hoa kỳ, trước năm 1997 có rất ít báo cáo về các ngộ độc gây ra bởi V.
parahaemolyticu; tuy nhiên chỉ từ năm 1997 - 1998 đã có 4 ổ dịch liên quan đến
việc tiêu thụ hàu sống hoặc chưa được nấu chín, ảnh hưởng hơn 700 người. Sự gia
tăng đáng kể các vụ ngộ độc do V. parahaemolyticus gây ra ở Hoa Kỳ có liên quan
đến chủng huyết thanh O3:K6 mà trước đây chỉ liên quan đến bệnh ở Châu Á
(Sakazaki và cộng sự, 2005).
Ở Mexico, trong tổng số 266 mẫu nước biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ
12 điểm khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau
trong năm cho thấy: V. parahaemolyticus được tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên.
Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến sự phân bố của V.
parahaemolyticus trong môi trường bao gồm nhiệt độ nước, nồng độ muối và oxy,
sự tương tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền
phù, cá và hải sản cũng như sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng
sự, 2004).


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2008) Thí nghiệm vi sinh vật
thực phẩm. Nhà xuất bản đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ
Chí Minh. 152 tr.
2. Trần Linh Thước (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật trong
nước, thực phẩm và mĩ phẩm; Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, 230 tr.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Alcaide E., Amaro C., Todoli R. and Oltra R. (1999) Isolation and
characterization of Vibrio parahaemolyticus causing infection in Iberian
toothcarp (Aphanius iberus). Diseases Of Aquatic Organisms Vol. 35, p. 77-80.
Arun K. (2008) Foodborne Microbial Pathogens, Mechanisms and Pathogenesis. Series.
Food Science Text Series, XVIII, 276 p.
2. Bockemuhl J. and Triemer A. (1974) Ecology and epidemiology of
Vibrio parahaemolyticus on the coast of Togo. Bull World Health Organ, 51(4), p.
353–360.
3. Cabrera-Garcıa M.E., Vazquez-Salinas C., and Quinones-Ramırez E. I. (2004) Serologic and Molecular Characterization of Vibrio
parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of
Mexico. Applied and environmental microbiology. Vol. 70, No.11, p.6 401-6406.
4. Chan S.S.W., Ng K.C., Cheung W.L., Rainer T.H. (2002) Vibrio
parahaemolyticus: a leading cause of infectious diarrhoea in Hong Kong. Hong
Kong Journal of Emergency Medicine. Vol. 9(1).p. 23 – 29.
5. Chowdhury N.R., Chakraborty S., Ramamurthy T., Nishibuchi
M., Yamasaki S., Takeda Y., and Nair G.B Molecular Evidence of Clonal
Vibrarahaemolyticus Pandemic Strains. Emerging Infectious Diseases, Vol. 6, No.
6, p. 631-636.
6. Dupray E. and Cormier M. (1983) Optimal Enrichment Time For
Isolation of Vibrio parahaemolyticus From Seafood. Appl Environ Microbiol.
Vol. 46, No. 5, p. 1234-1235.
62
7. Fujino T., Sakazaki R., and Tamura K. (1974) Designation of the
Type Strain of Vibrio parahaemolyticus and Description of 200 Strains of the
Species. International Journal of systematic bacteriology, Vol.24, No.4, p. 447 -449.
8. Karunasagar I., Sam T., Joseph W., Robert M.T., Hada T.H. and
Rita R.C. (1994) Enhancement of Vibrio parahaemolyticus Virulence by Lysed
Erythrocyte Factor and Iron. Infection and Immunity, Vol. 46, No. 1, p. 141-144.
9. Kodama T., Gotoh K., Hiyoshi H., Morita M., Izutsu K. (2010)
Two Regulators of Vibrio parahaemolyticus Play Important Roles in Enterotoxicity
by Controlling the Expression of Genes in the Vp-PAI Region. PLOS ONE,
Volume 5, Issue 1, p. 1-12.
10. Lee C. and Pan C. (1993) Rapid and specific detection of the
thermostable direct haemolysin gene in Vibrio parahaemolyticus by the
polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology, 139, p. 3225-3231.
11. Makino K., Oshima K., Kurokawa K., Yokoyama K., Uda T.,
Tagomori K., Iijima Y., Najima M., Nakano M., Yamashita A., Kubota Y.,
Kimura S., Yasunaga T., Honda T., Shinagawa H., Hattori M., Tetsuya I
Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct
from that of V cholerae. Lancet; 361, p. 743–749.
12. Marlina E., Radu S., Kqueen C. Y., Napis S., Zakaria Z., Mutalib
S. A. and Nishibuchi M. (2007) Detection of tdh and trh genes in Vibrio
parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana prime in West Sumatera,
Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health. Vol 38 No. 2, p. 349-355.
13. McCarter L. (1999) The Multiple Identities of Vibrio
parahaemolyticus. J Trop Med Public Heal, Vol 38 No. 2, p. 51-57.
14. Miwa N., Kashiwagi M., Kawamori F., Masuda T., Sano Y., Hiroi
M. and Kurashige H. (2005) Levels of Vibrio parahaemolyticus and Thermostable
Direct Hemolysin Gene-positive Organisms in Retail Seafood Determined by the
63
Most Probable Number-polymerase Chain Reaction (MPN-PCR) Method. J. Food
Hyg. Soc. Japan, Vol. 47, No. 2, p. 41-45.
15. Nishibuchi M. and Kaper J. B. (1995) Thermostable direct
hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine
bacterium. Infection and immunity, Vol. 63, No. 6, p. 2093–2099.
16. Nishibuchi M. and James K. P. (1985) Nucleotide sequence of the
thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus. Journal of
Bacteriology, Vol. 162, No. 2, p. 558-564.
17. Okuda J., Nakai T., Chang P. S., Takanori O., Nishino T.,
Koitabashi T. and Nishibuchi M. (2001) The toxR Gene of Vibrio (Listonella)
anguillarum Controls Expression of the Major Outer Membrane Proteins but Not
Virulence in a Natural Host Model. Infection and Immunity, No 10, Vol 6, p.
6091–6101.
18. Rizvi A. V and Bej A.K. (2010) Multiplexed real-time PCR
amplification of tlh, tdh and trh genes in V.parahaemolyticus and its rapid
detection in shellfish and Gulf of Mexico water. Antonie van Leeuwenhoek, 98,
p.279 – 290.
19. Rujiwat A. (2007) Thesis entitled Identificcation of Vibrio Cholerae,
Vibrio parahaemolyticus, V. Vulnificus by Multiplex Polymerase Chain Reaction.
Mahidol University, ThaiLand, p. 114.
20. Sakazaki R., Kaysner C., Abeyta C (2005) Vibrio infections in
Foodborne infections and intoxications. Eds Riemann H.P and Cliver, London1,
185-204.
21. Stewart B. J. and McCarter L. (2003) Lateral Flagellar Gene
System of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 15, p.
4508-4518.
22. Tanil G. B., Radu S., Nishibuchi M., Napis R. A. R. S., Maurice L.
and Gunsalam J. W. Characterization Of Vibrio parahaemolyticus Isolated From
64
Coastal Seawater In Peninsular Malaysia, Southeast Asian J Trop Med Public
Health, Vol 36 No. 4, p. 940-945.
23. Tetsuya I., Park K. S., Suthienkul O., Kozawa J., Yamaichi Y.,
Yamamoto K. and Honda T. (1998) Close proximity of the tdh, trh and we genes
on the chromosome of Vibrio parahaemolyticus. Microbiology, 144, p. 2517-2523.
24. Tuyet D.T., Thiem V.D., Von Seidlein L., Chowdhury A., Park E.,
Canh D.G., Chien B.T., Van Tung T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy
T.H., Nichibuchi M., Clemens J. and Trach D.D. (2006) Clinical,
epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio
parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam. Infect Dis, 186(11), p. 1615–
1620.
25. Vesth T., Wassenaar T. M., Hallin P. F., Snipen L., Lagesen K.
and Ussery D. W. (2010) On the Origins of a Vibrio Species. Microb Ecol 59.
p1–13.
26. Wong H. C., Liu S. H., Wang T. K., Lee C. L., Chiou C. S., Liu D.
P., Nishibuchi M., and Lee B. K. (2000) Characteristics Of Vibrio
parahaemolyticus O3:K6 From Asia. Applied And Environmental Microbiology,
Vol. 66, No. 9, p. 3981–3986.
27. Yamaichi Y., Tetsuya I., Park K. S., Yamamoto K. and Honda M.
(1999) Physical and genetic map of the genome of Vibrio parahaemolyticus:
presence of two chromosomes in Vibrio species. Molecular Microbiology 31(5), p.
1513-1521.
28. Zhang X. H. and Austin B. (1998) Haemolysins in Vibrio species.
Journal Applied of Microbiology 2005, 98, p.1011-1019.
29. Zulkifli Y., Alitheen N. B., Son R., Yeap S. K., Lesley M. B. and Raha
A. R. (2009) Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the
toxR gene and detection of virulence genes. International Food Research Journal 16, p: