Luận Văn Xây dựng quy trình multiplex -pcr chẩn đoán đồng thời bệnh đốm trắng (wssv), bệnh còi (mbv) và bệnh

Đồ án tốt nghiệp
Đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX -PCR CHẨN ĐOÁN ĐỒNG THỜI BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV), BỆNH CÒI (MBV) VÀ BỆNH GAN TỤY (HPV) TRÊN THỦY SẢN


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH 5
1.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thếgiới 5
1.2Tình hình dịch bệnh tôm ởViệt Nam . 6
2. TỔNG QUAN VỀCÁC BỆNH NHIỄM 7
2.1. Đặc điểm sinh học và biểu hiện bệnh lí 7
2.1.1. Bệnh đốm trắng (WSSV –White spot syndrome virus) . 7
2.1.1.1 Phân loại . 7
2.1.1.2 Hình thái . 8
2.1.1.3. Cấu trúc protein và vật chất di truyền . 9
2.1.1.4. Phổký chủ . 9
2.1.1.5. Cơchếxâm nhiễm . 9
2.1.1.6. Dấu hiệu bệnh lý . 11
2.1.1.7. Phương thức lây nhiễm bệnh 12
2.1.2. Bệnh còi (MBV –Monodon Baculovirus) 12
2.1.2.1. Phân loại 13
2.1.2.2. Hình thái 13
2.1.2.3. Cấu trúc protein và vật chất di truyền . 14
2.1.2.4. Phổký chủ . 14
2.1.2.5. Cơchếxâm nhiễm . 15
2.1.2.6. Dấu hiệu bệnh lý . 16
2.1.2.7. Phương thức lây nhiễm bệnh 16
2.1.3. Bệnh teo gan tụy (HPV –Hepatopancreatic Parvovirus) . 17
2.1.3.1. Phân loại 17
2.1.3.2. Hình thái 18
2.1.3.3. Cấu trúc protein và vật chất di truyền . 18
2.1.3. Phổký chủ 18
2.1.3.5. Cơchếxâm nhiễm . 19
2.1.3.6. Biểu hiện bệnh lý 19
65
2.1.3.7. Phương thức lây nhiễm bệnh 20
3. MỘT SỐPHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH . 20
3.1. Phương pháp mô bệnh học 20
3.2. Phương pháp lai . 21
3.3. Phương pháp miễn dịch . 21
3.4. Phương pháp PCR . 21
3.4.1. Phương pháp MULTIPLEX –PCR 22
3.4.2. Kỹthuật nested PCR. . 22
3.4.3. Kỹthuật real-time PCR 23
3.4.3.1. Sửdụng SYBR GREEN 24
3.4.3.2. Dùng đoạn dò TaqMan (TaqMan probe) 24
3.5. Phương pháp giải trình tự 25
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 27
1. VẬT LIỆU . 28
1.1. Mẫu bệnh . 28
1.2. Mồi 28
1.3. Vật liệu hóa chất 28
1.3.1. Vật liệu hóa chất dùng cho tách chiết DNA . 28
1.3.2 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Công Ty CổPhần Công
NghệViệt Á) 28
1.3.3. Vật liệu hóa chất dùng cho điện di . 29
2. THIẾT BỊVÀ DỤNG CỤ . 29
3. PHƯƠNG PHÁP 30
3.1. Phương pháp xứlý và bảo quản mẫu 30
3.1.1. Phương pháp thu nhận mẫu tôm 30
3.1.2. Phương pháp tiền xửlý và bảo quản mẫu 31
3.1.2.1. Hóa chất dùng cho xửlý mẫu (bảo quản tối, nhiệt độ2 -8
o
C) 31
3.1.2.2. Tiến hành xửlý mẫu . 31
3.2. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA 31
3.2.1. Nguyên tắc . 31
3.2.2. Các bước tiến hành . 31
3.2. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MỒI TRÊN LÍ THUYẾT 32
3. PHƯƠNG PHÁP PCR . 33
66
3.3.1. Thành phần phản ứng PCR 34
3.3.2. Cách tiến hành 34
3.4. PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN GI TRÊN GEL AGAROSE . 34
3.4.1. Nguyên tắc . 34
3.4.2. Tiến hành 35
3.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘLAI TỐI ƯU CỦA MỒI 35
3.6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI . 36
3.6.1. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của mồi trên lí thuyết . 36
3.6.2. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm . 36
3.7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘNHẠY CỦA QUY TRÌNH 36
PHẦN III: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 37
1. KẾT QUẢTHIẾT KẾMỒI . 38
2. KẾT QUẢKHẢO SÁT MỒI TRÊN LÍ THUYẾT . 38
2.1. Kết quảkiểm tra độtương đồng của các trình tựbằng ClustalX và BioEdit . 38
2.2. Kết quảkhảo sát tính đặc hiệu và khảnăng nhân bản chọn lọc của mồi trên
lý thuyết 41
2.3. Kết quảkiểm tra các đặc tính của mồi bằng phần mềm trực tuyến Oligo
Analyzer 3.0 trên trang web của IDT . 43
2.4. Kết quảkiểm tra sựbắt cặp của ba cặp mồi trong phản ứng Multiplex –PCR
bằng phần mềm của công ty IDT. 45
3. KẾT QUẢXÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX –PCR . 46
3.1. Kết quảkhảo sát sựhoạt động của mồi trên thực nghiệm. . 46
3.2. Kết quảkhảo sát phản ứng Multiplex –PCR tỉlệmồi 1:1:1. 48
3.3. Kết quảkhảo sát nhiệt độlai tối ưu . 49
3.4. Kết quảkhảo sát độ đặc hiệu của ba cặp mồi . 50
3.5. Kết quảkhảo sát độnhạy của quy trình 52
3.6. Kết quảkhảo sát trên mẫu tôm thực tế 53
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀNGHỊ . 57
1 Kết luận . 58
2 Đềnghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤLỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với nhu cầu sửdụng thực phẩm từthủy hải sản đang ngày một
tăng cao thì cũng đồng nghĩa với việc khai thác các nguồn lợi thủy hải sản biển
cũng gia tăng gây cạn kiệt nguồn tài nguyên quý giá này. Trước tình hình đó việc
phát triển tựphát nghềnuôi trồng thủy sản, đặc biệt là sựbùng phát nghềnuôi
tôm biển là một thực tếkhách quan và là nhu cầu cần thiết. Ởnước ta, mặc dù
nghềnuôi tôm mới thực sựphát triển từnăm 1988 nhưng do lợi nhuận cao của
nghềvà do được sự ưu đãi của thiên nhiên nên ngành nghềnuôi tôm phát triển
khá nhanh đặc biệt ởmột sốtỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng
sông Cửu Long như: Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc
Trăng, Diện tích nuôi ngày càng được mởrộng hơn, hiện có hơn 260.000 ha
dùng đểnuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kĩthuật đã được
áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu vềcon giống, thức ăn, thuốc, với mục
tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất.
Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật
độrất cao. Do đó nếu kĩthuật nuôi chưa được đảm bảo, việc áp dụng khoa học kĩ
thuật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộthì vấn đềô nhiễm môi
trường nước, phá vỡmôi trường sinh thái, bùng nổvà lây lan dịch bệnh là một
thực tếkhông thểtránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho
nền kinh tế. Theo tài liệu thống kê vào cuối năm 1993 đầu 1994 dịch bệnh lan
rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng
(Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụthể.
Trong đó, WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm
trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tượng tôm
nuôi. Đặc trưng của bệnh là tỷlệchết cao và chết hàng loạt trong một thời gian
rất ngắn tại các ao nuôi. MBV (Monodon baculovirus) và HPV
(Hepatopancreatic parvovirus) là hai loại virus tuy không gây chết ồ ạt nhưng lại
làm cho tôm chậm lớn. MBV gây thiệt hại và gây chết ởgiai đoạn cuối của
3
postlavae (>90%) và giai đoạn juvenile (70%). Bên cạnh đó thì HPV lại chủyếu
xâm nhiễm trên tôm trong giai đoạn mid –juvenile khiến cho gan teo lại, hoại tử
nguy cơchết có thểlên đến 100% (trong vòng 4 -8 tuần). Hiện nay, ba loại
virus này đang gây nhiều trởngại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện
pháp chữa trị đặc hiệu. Vì vậy, ngoài biện pháp kỹthuật nuôi tốt còn phải có
phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quảnhằm giám sát ba mầm bệnh này từ
lúc thảgiống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bịnhiễm bệnh đểcó
biện pháp xửlý thích hợp. Việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử
trong đó có phương pháp PCR đểchẩn đoán bệnh trên tôm là nguồn công cụrất
hữu ích và đem lại nhiều hiệu quảcao vì khảnăng phát hiện nhanh nhạy và đặc
biệt là phương pháp Multiplex –PCR có thể đồng thời phát hiện được nhiều virus
trên tôm giúp hạn chế đáng kểthiệt hại cho nghềnuôi.
Được sựphân công của Viện Công NghệSinh Học - Môi Trường Trường
Đại Học Nha Trang tỉnh Khánh Hòa và được sự đồng ý hướng dẫn của Công Ty
CổPhần Công NghệViệt Á, chúng tôi tiến hành thực hiện đềtài:
“ Xây dựng quy trình Multiplex -PCR chẩn đoán đồng thời bệnh đốm
trắng (WSSV), bệnh còi (MBV) và bệnh gan tụy (HPV) trên thủy sản”.
Đây là một phương pháp mới có khảnăng phát hiện đặc hiệu đồng thời ba
loại bệnh trên tôm : bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh còi (MBV), bệnh teo gan tụy
(HPV). Chỉbằng một phản ứng duy nhất, mẫu tôm có thể được chẩn đoán chính
xác khảnăng nhiễm ba loại bệnh nói trên. Điều này có ý nghĩa rất lớn vì nó giúp
tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm và quan trọng hơn hết đó là giúp cho
nghềtôm có những phương pháp xửlý kịp thời khi thấy dấu hiệu có bệnh do tính
năng nhanh nhạy của phương pháp.
4
PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
5
1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH
1.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thếgiới
Hiện nay nghềnuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trởthành một
trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tếquốc dân của rất nhiều
nước trên thếgiới. Từnhững năm cuối của thập kỷ80, nghềnuôi tôm đã có
những bước phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ởgần 40
nước, đưa sản lượng tôm nuôi từtỷlệ2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với
tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm
1990 tăng 36,8% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 1995, sản lượng tôm
nuôi đạt 712.000 tấn, chiếm 27% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế
giới. Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 78% tổng sản lượng tôm nuôi, còn
lại là các nước Tây Bán Cầu (Rosenberry, 1995).
Hiện nay có khoảng 25 loài tôm đang được nuôi, nhưng chỉcó 5 loài đạt
sản lượng trên 10.000 tấn/năm và 3 loài đạt sản lượng 100.000 tấn/năm (BộThủy
Sản,1994). Trong đó loài tôm sú Penaeus monodonchiếm tới 53% tổng sản
lượng tôm nuôi ởkhu vực Châu Á – Thái Bình Dương. Vùng nuôi tôm sú tập
trung chủyếu ởChâu Á (Fast, 1992) điển hình ởcác quốc gia nhưThái Lan,
Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam, Đài Loan.
Trên thếgiới có khá nhiều hình thức nuôi tôm: nuôi quảng canh; nuôi
quảng canh cải tiến; nuôi bán thâm canh;thâm canh và nuôi kết hợp với cua,
cá (Liao, 1989). Và đểchọn lựa hình thức nuôi nào phù hợp lại phụthuộc vào
nhiều yếu tốnhư: kích thước ao, vốn đầu tư, kinh nghiệm quản lý, cơsởvật chất
hiện có, thịtrường tiêu thụsản phẩm (Kungvankij và Kongkeo, 1988).
Lịch sửphát triển nghềnuôi tôm ởnhiều nước nhất là vùng Đông Nam Á
cho thấy vấn đềthiệt hại do dịch bệnh trong nghềnuôi tôm là điều không thể
tránh khỏi, tùy theo mô hình nuôi, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh
sẽxuất hiện (Nguyễn Mạnh Hùng, 1994). Trung Quốc là nước có sản lượng tôm
cao nhất thếgiới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do bệnh dịch thiệt hại 50%
tổng sản lượng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú
nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bịdịch bệnh.
Indonesia cũng bịthiệt hại nặng nềdo môi trường xấu và do dịch bệnh. Trong
6
quý 3 năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳgiảm 38%.
Thái lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bịô
nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bịbệnh. Năm 1994, tôm nuôi ởThái Lan bị
chết gần 30.000 ha mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD (Phan Lương Tâm, 1994).
1.2 Tình hình dịch bệnh tôm ởViệt Nam
Bờbiển Việt Nam trải dài 3.260 km từQuảng Ninh đến Kiên Giang, là
tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Nghềnuôi tôm ở
nước ta mà đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cũng chỉmới phát
triển mạnh mẽvào cuối những năm 1980 với sựphát triển của một sốcác hình
thức nuôi nhưquảng canh cải tiến và bán thâm canh. Năm 1997, mô hình nuôi
tôm công nghiệp ởquy mô nông hộ700 – 1500 m
2
/ao (TS. Nguyễn Văn Hảo,
1998) được làm thí điểm tại Trà Vinh đạt năng suất 5 tấn/ha/vụ. Các mô hình
nuôi tôm công nghiệp đạt kết quảcao, tạo tiền đềcho chương trình phát triển
thâm canh hóa nghềnuôi tôm ởViệt Nam trong tương lai
Ngoài các hình thức nuôi tôm giống nhưtrên thếgiới: quảng canh, quảng
canh cải tiến, nuôi bán thâm canh và thâm canh thì nước ta cũng đã phát triển các
hình thức nuôi sinh thái : nuôi tôm – rừng, tôm – lúa Trong đó, hình thức nuôi
quảng canh được áp dụng phổbiến ởViệt Nam, đặc biệt là vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ
Quỳnh, 1992).
Tại Việt Nam, từcuối năm 1993 dịch bệnh tôm đã được báo động trên
toàn quốc, thiệt hại lớn nhất là ởcác tỉnh ĐBSCL (Phan Lương Tâm, 1994). Tính
đến 30 – 9 -1994, tổng diện tích nuôi tôm bịchết là 84.850 ha với thiệt hại ước
tính 5.520 tấn trịgiá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995). Năm 1995, sản lượng
tôm nuôi của Việt Nam là 50.000 tấn giảm còn 30.000 tấn năm 1997 (World
Shrimp Farming, 1997).
Theo TS. Nguyễn Văn Hảo và ctv năm 1997, tác nhân chính gây bệnh ở
tôm nuôi vùng ĐBSCL ngoài nhóm Vibrios còn có sựxuất hiện của hai tác nhân
Virus gây bệnh quan trọng là MBV ( Monodon baculovirus) và WSSV ( White
Spot Syndrome Virus).
Tác nhân gây bệnh Virus hiện nay được xem là một trong những tác nhân
gây bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trịbệnh do virus không hiệu quảvì hiện


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
o HồHuỳnh Thùy Dương. Sinh học phân tử_ NXB Giáo Dục 2008
o Ts. Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị-
Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.
o Ts.Nguyễn Văn Hảo, 2004. Một sốbệnh thường gặp trên tôm sú
(Penaeus monodon) các phương pháp chẩn đoán và biện pháp phòng trị. Nhà
xuất bản Nông Nghiệp, Thành phốHồChí Minh.
o Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, 2002. Các bệnh thường
gặp trên tôm nuôi thương phẩm và phương pháp chẩn đoán. Nhà xuất bản Thành
phốHồChí Minh.
o Lý ThịThanh Loan, Luận án tiến sĩsinh học chuyên ngành Vi sinh,
Khoa Sinh, Đại học Khoa học tựnhiên Tp.HCM. Shambrook J., Russell W. D.,
Molecular cloning, a laboratory manual, Thirth edition,2001, CSHL press, Cold
Spring Habor, New York.
2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
o Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung
Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh and Peter J. Walker,
Nimaviridae: A new virus family infecting aquatic invertebrates, XIIth
International Congress ofVirology, Paris, 2002.
o C M Escobedo-Bonilla, V Alday-Sanz, M Wille, P Sorgeloos, M B
Pensaert, H J Nauwynck, A review on the morphology, molecular
characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus,
Journal of Fish Diseases 2008, 31, 1–18.
o Van Hulten M. C., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer N.,
Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Klein L. R., Vlak J. M, The white spot
syndrome virus DNA genome sequence, 2001, Virology 286, 7 – 22.
o Javier Robalino , Caroline Payne , Pamela Parnell , Eleanor
Shepard , Adrian C. Grimes , Adrienne Metz, Sarah Prior, Jeroen
Witteveldt, Just M. Vlak , Paul S. Gross, Gregory Warr, Craig L.
Browdy Inactivation of White Spot Syndrome Virus (WSSV) by normal rabbit
60
serum: Implications for the role of the envelope proteinVP28 in WSSV infection
of shrimp
o Juan C. García , AlejandroReyes , Marcela Salazar , Clarissa B.
Granja .Differential gene expression in White Spot Syndrome Virus (WSSV)-infected naïve and previously challenged Pacific white shrimp Penaeus
(Litopenaeus) vannamei.
o D.V. Lightner , R.M. Redman. Shrimp diseases and current
diagnostic methods
o Alejandro Reyes, Marcela Salazar, Clarissa Granja Temperature
modifies gene expression in subcuticular epithelial cells of white spot syndrome
virus-infected Litopenaeus vannamei
o Paisarn Khawsak , Warin Deesukon a, Parin Chaivisuthangkura
b, Wasana Sukhumsirichart Multiplex RT-PCR assay for simultaneous
detection of six viruses of penaeid shrimp .
o T.W. Flegel Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, a
historical perspective with emphasis on Thailand.
o Karlo Dante T. Natividad, Maria Veron P. Migo, Juan D.
Albaladejo, Jose Paolo V. Magbanua, Nakao Nomura, Masatoshi
Matsumura Simultaneous PCR detection of two shrimp viruses (WSSV and
MBV) in postlarvae of Penaeus monodon in the Philippines.
o Wasana Sukhumsiricharta, Pongsopee Attasartb, Vichai
Boonsaengc, Sakol Panyim Complete nucleotide sequence and genomic
organization of hepatopancreatic parvovirus (HPV) of Penaeus monodon.
o Chamberlain, J.S., R.A. Gibbs, J.E.Ranier, P.N. Nguyen and C.T.
Caskey. 1988.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via
multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16:11141- 11156.
3. TÀI LIỆU ĐIỆN TỬ
o http://www.agriviet.com
o http://www.khoahocthuysan.org.
o http://www.mekongfish.net.vn.
o http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
o http://www.sciencedirect.com.
o http://www.idtdna.com