Thạc Sĩ Xây dựng quy trình Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) dựa vào gen cpn60 nhằm phát hiện St

Lời mở đầu
Liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S. suis) là tác nhân gây bệnh hàng đầu trên heo ở các nước có nền kinh tế chăn nuôi heo phát triển.
Streptococcus suis cư trú ở tuyến hô hấp trên, tuyến sinh dục và tuyến tiêu hóa của heo. Có 35 serotype S. suis đã được xác định và ghi nhận, trong đó serotype 2 là serotype phổ biến nhất thường được phân lập từ heo bệnh và người bệnh. Ngoài ra một số trường hợp gây bệnh ở người do serotype 14, 16 cũng đã được phát hiện và báo cáo.
Các ca bệnh trên người xảy ra rải rác tại nhiều nước trên thế giới tuy nhiên đa số trường hợp bệnh được ghi nhận ở các nước Châu Á, nhất là Trung Quốc và vùng Đông Nam Á. Tại Việt Nam, S. suis serotype 2 là tác nhân hàng đầu gây bệnh viêm màng não mủ ở người lớn. Nhiễm S. suis trên người được xem là bệnh nghề nghiệp đối với các đối tượng tiếp xúc thường xuyên với heo và thịt heo như người làm công tác thú y, chăn nuôi, buôn bán, giết mổ và chế biến thịt heo. Vì thế việc tầm soát và xác định tỷ lệ heo mang trùng S. suis có thể góp phần giúp chúng ta có biện pháp giảm nguy cơ gây bệnh trên heo và người. Đây là vấn đề cần được quan tâm.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật cho phép phát hiện và phân lập S. suis, trong đó phổ biến nhất là nuôi cấy vi sinh và PCR. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy định danh vi khuẩn bằng kit thương mại dựa trên các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn (API 20 Strep, Biomerieux) và PCR là những phương pháp đòi hỏi chi phí cao nên khó áp dụng tại các chi cục thú y và các trung tâm y tế địa phương. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng và phát triển phương pháp Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) với các ưu điểm: chính xác, hiệu quả, giá thành thấp, kết quả ghi nhận bằng sự chuyển màu, quan sát bằng mắt thường và dễ thực hiện hơn so với phương pháp PCR truyền thống và nuôi cấy vi sinh. Phương pháp LAMP hứa hẹn là phương pháp sinh học phân tử có thể ứng dụng rộng rãi, đặc biệt tại các phòng thí nghiệm với điều kiện cơ sở vật chất hạn chế,
nhằm xác định S. suis không những trong phòng thí nghiệm mà còn trong điều kiện thực địa.Với các tiền đề như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng quy trình Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) dựa vào gen cpn60 nhằm phát hiện Streptococcus suis”.
 Mục đích nghiên cứu
 Mục tiêu đề tài
- Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát hiện Streptococcus suis
- So sánh độ nhạy giữa phương pháp LAMP với nuôi cấy vi sinh.
 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP trong việc phát hiện đặc hiệu toàn bộ các serotype của S. suis. Nghiên cứu của chúng tôi có thể được xem là đề tài nghiên cứu đầu tiên nhằm xây dựng quy trình LAMP phát hiện S. suis hiệu quả, chính xác, chi phí thấp với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Những ưu điểm của phương pháp LAMP cho thấy đây là phương pháp có nhiều tiềm năng ứng dụng rộng rãi nhằm tầm soát nhiễm S. suis trên đàn heo nuôi và cả trong chẩn đoán bệnh nhiễm ở người.

MỤC LỤC
Mục lục . trang i
Danh mục hình . trang iv
Danh mục, bảng, đồ thị trang vi
Bảng các chữ viết tắt . trang vii
1. Tổng quan . 1
1.1 Đặc điểm chung . 1
1.1.1 Hình thái, phân loại và một số đặc điểm sinh học 1
1.1.2 Phân loại các serotype 2
1.1.3 Các serotype thường gây bệnh và ít gây bệnh ở người và heo . 3
1.1.4 Nhiễm S. suis ở heo . 3
1.1.4.1 Phương thức lây truyền . 3
1.1.4.2 Triệu chứng lâm sàng trên heo . 4
1.1.5 Nhiễm S. suis ở người . 4
1.1.5.1 Đối tượng có nguy cơ lây nhiễm . 5
1.1.5.2 Triệu chứng lâm sàng trên người 6
1.2 Tình hình nhiễm S. suis 7
1.2.1 Nhiễm S. suis trên thế giới . 7
1.2.2 Nhiễm S. suis ở Việt Nam 8
1.3 Cơ chế phát sinh bệnh 9
1.3.1 Khu trú: quá trình gắn kết và xâm nhiễm bề mặt biểu mô 9
1.3.2 Xâm nhiễm: phát tán và tồn tại trong dòng máu . 9
1.3.3 Hoạt hóa đáp ứng viêm và sốc nhiễm trùng huyết 10
1.3.4 Xâm nhiễm hệ thần kinh trung ương (CNS) và gây viêm màng não 11
1.4 Chaperonin 13
1.4.1 Nguồn gốc 13
1.4.2 CPN60 13
Trang ii
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
1.4.2.1 Cấu trúc . 13
1.4.2.2 Sự hiện diện gen cpn60 14
1.4.2.3 Chức năng . 15
1.4.2.4 Tiềm năng gen cpn60 . 16
1.5 Phương pháp Loop mediated isothermal amplification (LAMP) 17
1.5.1 Sơ lược về một số phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh 17
1.5.2 Lịch sử ra đời và ứng dụng của phương pháp LAMP 18
1.5.3 Nguyên tắc hoạt động LAMP . 18
1.5.4 Cơ chế hoạt động 19
1.5.5 Đánh giá kết quả LAMP . 21
1.5.5.1 Đánh giá kết quả LAMP bằng điện di 21
1.5.5.2 Quan sát kết quả LAMP bằng mắt thường . 22
1.5.6 Ưu điểm phương pháp LAMP 24
2. Vật liệu và phương pháp 25
2.1 Vật liệu . 25
2.1.1 Chủng vi khuẩn S. suis . 25
2.1.2 Trang thiết bị và hóa chất . 25
2.2 Các kỹ thuật trong nghiên cứu 27
2.2.1 Quy trình tách chiết DNA từ chủng thuần . 27
2.2.2 Tách chiết DNA vi khuẩn gram dương từ mẫu máu toàn phần dựa theo quy trình DNeasy Blood and Tissue Kit . 30
2.2.3 Phương pháp Miles - Misra cấy trải theo bậc pha loãng và đếm CFU ước tính mật độ vi khuẩn trong dung dịch 32
2.2.4 Thiết kế mồi và thành phần phản ứng PCR . 34
2.2.4.1 Thiết kế mồi dựa trên gen cpn60 của S. suis trong phản PCR 34
2.2.4.2 Hóa chất và dụng cụ dùng trong PCR 35
2.2.4.3 Thành phần phản ứng PCR 35
2.2.5 Thiết kế mồi và thành phần phản ứng trong phương pháp LAMP 37
Trang iii
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
2.2.6 Tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng . 42
2.2.7 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng PCR và LAMP 42
2.2.8 So sánh độ nhạy giữa phương pháp LAMP và phương pháp nuôi cấy 43
3. Kết quả . 46
3.1 Xác định độ đặc hiệu của mồi cpn60 bằng phản ứng PCR . 46
3.2 Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát hiện S. suis 48
3.2.1 Quan sát kết quả LAMP bằng điện di và chất chỉ thị Pico green 48
3.2.2 Khảo sát độ đặc hiệu của Pico Green . 49
3.2.3 Tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng . 50
3.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng . 50
3.2.3.2 Nồng độ Betaine . 51
3.2.3.3 Nồng độ dNTPs . 52
3.2.3.4 Thời gian phản ứng . 53
3.2.3.5 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng LAMP 54
3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy 57
3.3.1 Khảo sát nồng độ kháng sinh ceftriaxone có thể gây chết S.suis CM368 57
3.3.2 Xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian (time kill-curve) của chủng S. suis CM 368 trong môi trường có ceftriazone nồng độ 8xMIC 62
3.3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP . 64
3.4 Thảo luận . 65
4. Kết luận – Đề xuất 67
4.1 Kết luận . 67
4.2 Đề xuất 67
Tài liệu tham khảo 68
Phụ lục . 76