Luận Văn Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC

Đồ án tốt nghiệp
Đề tài: Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC


MỤC LỤC
PHẦN 1: TỔNG QUAN .- 3 -
1.1. TỔNG QUAN VỀTOBRAMYCIN .-7 -
1.1.1. Công thức cấu tạo .- 7 -
1.1.2. Tính chất lý hóa - 7 -
1.1.3. Nguồn gốc - 7 -
1.1.4. Dược động học - 7 -
1.1.5. Tác dụng và cơchếtác dụng - 8 -
1.1.6. Chỉ định .- 8 -
1.1.7. Chống chỉ định - 9 -
1.1.8. Dạng bào chếvà liều lượng - 9 -
1.2. MỘT SỐPHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN - 9 -
1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh - 9 -
1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] .- 9 -
1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] . - 10 -
1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] - 10 -
1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp đo quang phổhấp thụ
UV-VIS - 11 -
1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] - 11 -
1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] - 11 -
1.2.3 Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC . - 12 -
1.2.2.1 Phương pháp 1[14] - 12 -
1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - 12 -
1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] - 13 -
1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] . - 13 -
1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] - 14 -
1.2.2.6. Phương pháp 6[5] . - 14 -
1.2.2.7. Phương pháp 7 [9] . - 15 -
1.3. TỔNG QUAN VỀPHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) - 16 -
1.3.1. Nguyên tắc . - 16 -
1.3.2. Cơsởlý thuyết - 17 -
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệthống HPLC - 17 -
1.3.3.1. Hệthống bơm - 17 -
1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệthống xửlý dung môi . - 17 -
1.3.3.3. Hệtiêm mẫu - 17 -
1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC . - 18 -
1.3.3.5. Detector trong HPLC - 18 -
1.3.3.6. Thiết bịhiển thịkết quả . - 18 -
- 5 -
1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký - 19 -
1.3.5. Cơsởlý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký . - 21 -
1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] . - 21 -
1.3.5.2. Lựa chọn pha động cho HPLC[12], [18] - 22 -
1.3.5.3. Chọn đệm pH . - 23 -
1.3.5.4. Tốc độdòng - 23 -
1.3.6. Cách đánh giá pic . - 23 -
1.3.7. Ứng dụng của HPLC - 24 -
1.3.7.1. Định tính và thử độtinh khiết: . - 24 -
1.3.7.2. Sắc ký điều chế: - 24 -
1.3.7.1. Định lượng: - 24 -
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 26 -
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM . - 26 -
2.1.1. Nguyên vật liệu : . - 26 -
2.1.1.1. Nguyên liệu và hoá chất: . - 26 -
2.1.1.2. Dụng cụ: - 26 -
2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu - 26 -
2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu . - 26 -
2.1.2.2. Nội dung nghiên cứu . - 27 -
2.2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 28 -
2.2.1. Xây dựng quy trình kỹthuật để định lượng tobramycin bằng
phương pháp HPLC . - 28 -
2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký . - 28 -
2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: - 28 -
a. Khảo sát chọn bước sóng thích hợp - 28 -
Hình 1: Phổhấp thụcủa dung dịch tobramycin 0,02% . - 29 -
b. Lựa chọn cột: - 29 -
c. Lựa chọn đệm: - 29 -
d. Lựa chọn pha động: - 30 -
e. Lựa chọn tốc độdòng . - 30 -
đ. Điều kiện sắc ký lựa chọn . - 31 -
2.2.2. Qui trình định lượng - 31 -
2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệthống . - 32 -2.2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng . - 32-
2.2.2.3. Điều kiện sắc ký - 33 -
2.2.2.4. Tính kết quả . - 33 -
2.2.3. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây
dựng - 34 -
2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng - 35 -
2.2.4.1. Tính tuyến tính - 35 -
- 6 -
2.2.4.2. Tính chính xác . - 37 -
2.2.4.3. Tính đúng . - 37 -
Bảng 6: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp . - 38 -
2.2.4.4. Tính đặc hiệu . - 39 -
2.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ . - 40 -
KẾT LUẬN VÀ ĐỀXUẤT - 43 -
3.1 KẾT LUẬN . - 43 -
3.2 ĐỀXUẤT - 43 -


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀTOBRAMYCIN
1.1.1. Công thức cấu tạo
C18H37N5O9
PTL: 467.5
Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21].
1.1.2. Tính chất lý hóa
Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong
ethanol, thực tếkhông tan trong cloroform và ether.
Góc quay cực riêng [α]
D
20
: +138
0
đến +148
0
[7]
1.1.3. Nguồn gốc
Chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể
bán tổng hợp từkanamycin B [7].
1.1.4. Dược động học
Tobramycin hầu nhưkhông hấp thu qua đường tiêu hoá nhưng hấp thu
tốt qua đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kết với protein huyết
- 8 -
tương. Do phân tửphân cực mạnh nên khó đi vào các mô kểcảnão. Thuốc
đạt nồng độcao trong vỏthận. Khi sửdụng cho phụnữmang thai, thuốc tích
lũy trong thai gây độc cho cảmẹvà con. Tobramycin đào thải chủyếu qua
thận nên phải giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh
đểtránh độc tính. Hiện nay, tobramycin được dùng với chế độmột liều cao và
duy nhất trong ngày. Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trịcao hơn và ít
độc tính hơn so với dùng liều nhỏvà nhiều lần trong ngày nhưtrước đây. Đối
với các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ởngười giảm neutrophile và các ca
suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của
tobramycin: 2 - 5 giờ[6]
1.1.5. Tác dụng và cơchếtác dụng
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên
nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc
không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa sốcác vi khuẩn yếm khí.
Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính:
chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với
protein, thểtích phân bốvà sựbài tiết chủyếu qua lọc ởcầu thận.
Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn
các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cảgentamycin.
Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi
khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của
ribosom [2], [11].
1.1.6. Chỉ định
Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng,
đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn
huyết do vi khuẩn Gr (-).
- 9 -
Trong điều trịcác bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm
khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng
phối hợp với m ột kháng sinh nhóm beta-lactam.
Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalishoặc alpha -
Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc
benzylpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. [2]
1.1.7. Chống chỉ định
Người có tiền sửdị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, người
nghe kém và người có bệnh thận. [2]
1.1.8. Dạng bào chếvà liều lượng
Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml
(người lớn), 10 mg/ml (trẻem). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ.
Lọ5 ml 0,3 % đểnhỏmắt. Tuýp 3,5 g mỡtra mắt 0,3 %.
Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trịnhiễm
P. aeruginosa đường hô hấp ởbệnh nhân bịxơnang hóa. [11]
1.2. MỘT SỐPHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN
1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh
1.2.1.1. Phương pháp 1 [15]
- Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501.
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 ±0,1
Dikali hydrophosphat : 5,59 g
Kali dihydrophosphat : 0,41 g
- Môi trường định lượng:
Pepton : 5,0 g
Cao thịt : 3,0 g
Dikali hydrophosphat : 3,0 g
Thạch : 15,0 - 20,0 g