Thạc Sĩ Xây dựng quy trình định lượng CMV trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR

MỞ ĐẦU

Nhiễm Cytomegalovirus (CMV) là loại nhiễm virus thường gặp trong cộng đồng, chiếm tỉ lệ
từ 60% đến 99% người lớn trên toàn thế giới [51], nhưng hiếm khi gây ra triệu chứng lâm sàng, vì
vậy chẩn đoán nhiễm CMV ít khi được quan tâm.
CMV là tác nhân sinh bệnh nhiễm trùng cơ hội và nguy cơ bệnh CMV tùy thuộc sự đáp ứng
miễn dịch của cơ thể. Nhiễm CMV sẽ tái kích hoạt khi bệnh nhân có hệ thống miễn dịch suy yếu, và
là tác nhân gây bệnh nặng, thậm chí gây tử vong cho những người sử dụng thuốc ức chế miễn dịch,
cũng như những người cấy ghép nội tạng, và đặc biệt những người nhiễm virus HIV.

CMV còn là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bẩm sinh thường gặp ở thai phụ-
nhiễm trùng ToRCH (Toxoplasmase, Rubella, CMV, Herpes simplex virus), gây nguy hại cho thai
nhi: 0,5%-2,5% trẻ sơ sinh mắc bệnh CMV bị vàng da, lách to, giảm tiểu cầu, suy thai, nhỏ đầu,
viêm võng mạc, CMV có thể để lại di chứng khốc liệt lúc mới sinh[11], [12], [13], [24], [72]. Ngoài
ra, một nghiên cứu mới tại Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) xuất bản trong số ra
ngày 15 tháng 5 năm 2009, cho thấy lần đầu tiên CMV, là một nguyên nhân gây ra huyết áp cao, khi
kết hợp với yếu tố nguy cơ khác đối với bệnh tim, CMV có thể gây ra xơ vữa, hoặc xơ cứng động
mạch [51].

Do đó, chẩn đoán sớm nhiễm CMV để đánh giá chính xác tình trạng của bệnh nhân là rất cần
thiết. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chẩn đoán nhiễm CMV như tìm kháng thể IgG-CMV,
IgM-CMV, nuôi cấy virus, tìm tế bào nội mô đều cho kết quả khả quan. Đặc biệt, cùng với sự phát
triển của sinh học phân tử, người ta cũng đã sử dụng PCR định tính CMV nhưng phương pháp này
khó phân biệt nhiễm tiềm tàng (nhiễm CMV không biểu hiện triệu chứng) hay nhiễm họat động
(nhiễm CMV biểu hiện triệu chứng).

Jiska Jebbink, và cộng sự [42] đã chỉ ra rằng nếu số lượng CMV khoảng 10.000 genomes
virus /ml mẫu máu là báo trước nhiễm CMV có nguy cơ cao phát triển thành bệnh CMV. Ngoài ra
còn một số công trình khác cũng chỉ ra mối tương quan giữa số lượng virus trong mẫu thử và bệnh




Vì vậy, việc định lượng CMV sẽ giúp các bác sĩ tiên lượng và có liệu pháp chữa trị sớm. Phát
hiện kháng nguyên pp65 trong máu cũng giúp cho việc định lượng CMV hữu hiệu, nhanh, nhưng
cũng còn nhiều nhược điểm. Trong thời gian gần đây, từ 1993 đến nay phương pháp Real-Time
PCR được sử dụng nhiều ở nước ngoài [18], [26], [27] ,[28], [32], [33], [42], [46], [53], [56], [59],
[70] định lượng CMV nhanh, chính xác , độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã giúp cho sự tiên lượng
những bệnh nhân nhiễm CMV có nguy cơ phát triển thành bệnh CMV để kịp thời chữa trị, đồng
thời còn giúp cho việc theo dõi kiểm tra hiệu lực liệu pháp chữa trị.

Tại Việt Nam cho đến nay, ở miền Nam Việt Nam, một vài nơi như công ty cổ phần công
nghệ Việt Á, công ty khoa Thương, công ty Nam Khoa, bệnh viện Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh, bệnh
viện Chợ Rẫy có kit thử định lượng CMV từ máu bệnh nhân bằng Real-Time PCR, chưa thấy công
trình nào xây dựng kỹ thuật định lượng CMV từ nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR.
Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Xây dựng quy trình định lượng CMV trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR”.

Giới hạn đề tài:
Hiện nay, có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-Time PCR với độ nhạy
tương đương như Molecular beacon, chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi, probe lai, probe thủy giải (TaqMan probe). Đề tài chọn kiểu phản ứng dùng TaqMan probe, vừa đơn giản, vừa có tính đặc
hiệu cao.

Nhiệm vụ đề tài :
- Thiết kế primers, TaqMan probe đặc hiệu định lượng CMV.
- Khảo sát các điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real-Time PCR và xây dựng quy
trình định lượng CMV trong máu và trong nước tiểu.
- Ứng dụng quy trình chẩn đoán trên một số bệnh phẩm.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Những mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV tại các phòng xét nghiệm của BV Từ Dũ, trung tâm y
khoa Medic, công ty cổ phần công nghệ Việt Á.
Đề tài được thực hiện tại phòng kỹ thuật của bộ môn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y
Dược TP. Hồ Chí Minh và công ty cổ phần công nghệ Việt Á.