Luận Văn Xây dưng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi bằng phương pháp sinh học phân tử

TÓM TẮT


Xây dưng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi bằng phương pháp sinh học phân tử



Đề tài được thực hiện trên đối tượng là vi khuẩn Xanthomonas spp. Đây là vi


khẩn có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hưởng rất lớn đến


năng suất của cây trồng. Chúng tôi sử dụng các kỹ thuật nông học, phương pháp sinh


học phân tử nhằm định danh dòng Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây bưởi mục


tiêu hiểu rõ bản chất sinh học của dòng gây bệnh, để dễ dàng cho việc đưa ra các biện


pháp phòng trừ bệnh do vi khuẩn này gây ra. Đề tài được thực hiện tại phòng thực tập


Bệnh cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông


Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 06/02/06 đến 06/08/06.


Nội dung nghiên cứu:


1. Phân lập, nuôi cấy, xác định gram, quan sát hình thái trên môi trường PGA, YDC.


2. Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn


phân lập được.


3. Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trưng để nhận Xanthomonas sp


4. Tiến hành nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số.


5. Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và


Xan332.


6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và


XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri.


Kết quả đạt được:


1. Phân lập được 4 dòng vi khuẩn, tất cả là gram âm, trên môi trường YDC phân


thành 2 nhóm vàng sữa và vàng chanh


2. Tất cả 4 dòng phân lập được đều tạo vết thương sau khi chủng bệnh nhân tạo,


triệu chứng bệnh có khác nhau.


3. Kết quả sắc ký có 1 dòng (XBDL1) có sắc tố phát sáng rõ sau khi chụp UV.


4. Thực hiện thành công phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer


Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb.


5. Không thực hiện được phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên


biệt XACR và XACF.


MỤC LỤC


TRANG


Trang bìa


Trang tựa


Lời cảm ơn .iii


Tóm tắt .iv


Mục lục v


Danh sách các hình viii


Danh sách các bảng .ix


Danh sách các chữ viết tắt .xi


Phần 1. GIỚI THIỆU 1


1.1. Đặt vấn đề 1


1.2. Mục đích . 1


1.3. Yêu cầu . 2


1.4. Giới hạn của đề tài . 2


Phần 2. TỔNG QUAN .3


2.1. Sơ lược về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nước .3


2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bưởi 3


2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nước 3


2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam .4


2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới 4


2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) .5


2.2.1. Triệu chứng bệnh .5


2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri) . 7


2.3. Sơ lược vùng rDNA-ITS 8

2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA .8


2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. .9


2.4. Sơ lược về hrpW gen .9


2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam .11


2.5.1. Trên Thế Giới .11


2.5.2. Tại Việt Nam .12


2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp 12


2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phương pháp


nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa .12


2.6.2 Quy trình định danh theo phương pháp phân tử 13


2.7 Phương pháp PCR 13


Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP .16


3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .16


3.2. Nội dung nghiên cứu .16


3.3 Vật liệu nghiên cứu .16


3.4. Phương pháp tiến hành 17


3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trường PGA và YDC, xác định


Gram âm hay Gram dương các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi 17


3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo 18


3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn 18


3.4.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 20


3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen 21


3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập


với cặp mồi Xan1330 và Xan332 . 22


3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập


với cặp mồi XACF và XACR 23


3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR 23


Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .25


4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở


cây bưởi da láng và bưởi đường cam . 25


4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trường PGA và YDC 25


4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo . 26


4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh 28


4.4 Ly trích DNA tổng số 28


4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS 29


4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen 29


Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .32


5.1. Kết luận 32


5.2. Đề nghị .32


Phần 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO 33


Phần 7. PHỤ LỤC .35