Tài liệu Xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaci

MỞ ĐẦU


Đậu tương (Glycine max(L.) Merr) hay còn gọi là đậu nành, là cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao. Khó có thể tìm thấy cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương. Là thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, rất giàu protein thực vật, chứa nhiều loại vitamin và chứa một lượng lớn axit béo chưa bão hòa rất tốt cho sức khỏe. Trong công nghiệp, đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu. Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Trong nông nghiệp, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phân bón. Ngoài ra, đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kg N [10].
Tuy nhiên, với tình hình khí hậu trên trái đất đang biến đổi không ngừng, nhiệt độ trái đất càng ngày càng tăng cao, từ đó dẫn đến các thiên tai (lũ lụt, hạn hán, bệnh dịch, ) gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng. Vì thế để tăng năng suất và chất lượng thì ngoài việc thực hiện chăm sóc, gieo trồng tốt còn phải tập trung nghiên cứu nhằm cải thiện các loại giống để chúng có thể cho năng suất cao, chống chịu được các điều kiện ngoại cảnh bất lợi tốt nhờ những ứng dụng to lớn của công nghệ sinh học hiện đại.
Trong hơn một thập niên vừa qua, công nghệ sinh học nói chung và cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bước phát triển vượt bậc. Từ khoảng 1 triệu ha đầu tiên năm 1996 trồng tại Châu Mỹ, đến tháng 12 năm 2009, toàn thế giới đã có 134 triệu ha cây trồng biến đổi gen [20], tăng 80 lần so với năm 1996 và tăng 9 triệu ha so với năm 2008 (125 triệu ha). Trong đó đậu tương biến đổi gen là loại cây biến đổi gen nổi bật nhất, có tới 69,7 triệu ha chiếm 52% trong tổng diện tích cây biến đổi gen toàn thế giới và chiếm tới 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương trên thế giới [14].
Các đánh giá mới nhất về tác động của cây chuyển gen cho thấy trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2008, lợi ích kinh tế trị giá 51,9 tỷ USD mà cây biến đổi gen mang lại được tạo ra từ 2 nguồn: thứ nhất là giảm chi phí sản xuất (50%) và tăng năng suất thu hoạch bền vững (50%). Số sản lượng tăng thêm này nếu không sử dụng các giống cây chuyển gen thì sẽ cần thêm 62,6 triệu ha để tạo ra chúng. Vì thế công nghệ sinh học giúp tiết kiệm diện tích trồng trọt, giảm được lượng thuốc trừ sâu ở mức 365 triệu kg, ứng với 8,4% tổng lượng thuốc trừ sâu sửu dụng trong nông nghiệp. Chỉ tính riêng trong năm 2008, lượng khí CO2 được cây biến đổi gen hấp thụ là 14,4 tỷ kg, tương đương với lượng khí thải mà 7 triệu chiếc oto thải ra.
Nước ta là một nước nông nghiệp với đặc điểm nổi bật là mật độ dân số cao vào loại nhất thế giới, bình quân đất nông nghiệp trên đầu người chỉ đạt khoảng 765m2/người. Diện tích đang ngày càng thu nhỏ lại, nhường chỗ cho thành thị, đường giao thông, khu dịch vụ và phát triển công nghiệp. Ước tính hàng năm chúng ta mất 50000-70000 ha đất canh tác. Trong khi đó biến đổi khí hậu toàn cầu, kéo theo sự xâm mặn nghiêm trọng, mưa gió bất thường gây ra hạn hán, lũ lụt, dịch bệnh đang đe dọa an ninh lương thực của đất nước. Liên hợp quốc đã xếp Việt Nam vào một trong 8 nước có nguy cơ về an ninh lương thực ở Châu Á. Đặc biệt, trong điều kiện mất đất canh tác, với mức tăng dân số như hiện nay, ngành nông nghiệp phải cung cấp thêm cho đất nước ít nhất 1 triệu tấn lương thực hàng năm.
Đậu tương là loại cây trồng được quan tâm và chú trọng nhất hiện nay, theo thống kê đến tháng 03/2010 diện tích trồng đậu tương của nước ta ở thời điểm này là 123,9 nghìn ha [12], sản lượng bình quân là 20 tạ/ha [11]. Tuy vậy nhưng hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng lớn đậu tương 2300 nghìn tấn (2009) [11], đứng thứ hai trên toàn Châu Á sau Indonesia. Bên cạnh đó, cây trồng biến đổi gen nói chung và đậu tương biến đổi gen nói riêng đã được chính phủ Việt Nam cho phép trồng rộng rãi bắt đầu từ năm 2011.
Xuất phát từ thực tế đó trong thời gian thực tập tốt nghiệp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
♦ Mục đích và yêu cầu của đề tài:
- Mục đích:
Xây dựng quy trình công nghệ chuyển gen gus có hiệu quả nhất để từ đó áp dụng chuyển các gen khác như gen kháng hạn, gen kháng sâu bệnh, gen kháng thuốc diệt cỏ, nhằm cải tạo giống đậu tương của Việt Nam.
- Yêu cầu: Trong khuôn khổ một bản đồ án tốt nghiệp, chúng tôi tập trung nghiên cứu cụ thể các nội dung sau:
* Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ban đầu
* Nghiên cứu quy trình biến nạp hiệu quả nhất, trong đó có:
· Xác định chủng vi khuẩn có khả năng chuyển gen hiệu quả nhất.
· Xác định mật độ quang (OD) của dung dịch khuẩn thích hợp nhất
· Xác định thời gian biến nạp thích hợp nhất
· Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm đến hiệu quả biến nạp.
· Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương chuyển gen
· Phân tích cây chuyển gen T0

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)
BAP : 6-benzylaminopurin
CaMV : Cailiflower Mosaic Virus
Car : Carbenicillin
DNA : Deoxirionucleic Acid
FAO : Food and Agriculture Organization
GFP : Green Fluorescent Protein
Gus : β-1,4-Glucuronidase
HPT : Hygromycin Phosphotransferase
ISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-Biotech
Ka : Kanamycin
LB : Luria Bertani
L-Cys : L-Cystein
MS : Murashige and Skoog, 1962
α-NAA : α-Napthalene acetic acid
NPT II : Neomycin Phosphotransferase II
PCR : Polymerase Chain Reaction
Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid
T-DNA : Transfer-DNA
USDA : United States Department of Agriculture
Vir : virulence

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1. Ti-Plasmid. 12
Hình 2. Cấu trúc chung của vector pCAMBIA 17
Hình 3. Vector pCAMBIA1301. 18
Hình 4. Quy trình thí nghiệm xác định chủng khuẩn thích hợp với giống đậu tương ĐT26 27
Hình 5. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch 28
Hình 6. Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp. 30
Hình 7. Quy trình thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn. 31
Hình 8. Quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT26. 33
Hình 9. Biểu hiện gus ở thí nghiệm xác định chủng vi khuẩn A.tumefaciens. 39
Hình 10. Ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD) đến tần. 41
Hình 11. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến tỷ lệ mẫu sống. 43
Hình 12. Đậu tương ĐT26 với thời gian biến nạp. 43
Hình 13. Đậu tương ĐT26 sau thí nghiệm sử dụng kim gây. 45
Hình 14. Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới 46
Hình 15. Các bước xây dựng quy trình tái sinh đậu tương sau chuyển gen. 49
Hình 16. Điện di ADN tổng số tách từ lá cây thí nghiệm 50
Hình 17. Ảnh hưởng của hygromycin khi thử nghiệmvới mẫu lá cây thí nghiệm và cây đối chứng 50
Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen gus. 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây. 9
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới trong những năm gần đây 9
Bảng 3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn). 10
Bảng 4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây. 10
Bảng 5. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes). 16
Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO 37
Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng. 37
Bảng 8. Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn. 39
Bảng 9. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch. 40
Bảng 10. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp. 42
Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp. 45
Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8). 58
Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7). 58
Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu. 59

MỤC LỤC

KÝ HIỆU VIẾT TẮT ii
DANH MỤC HÌNH VẼ iii
DANH MỤC BẢNG iv
MỤC LỤC v
MỞ ĐẦU 1
Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Giới thiệu chung về đậu tương. 4
1.1.1. Nguồn gốc. 4
1.1.2. Phân loại 4
1.1.3. Vai trò của đậu tương. 4
1.1.4. Sinh thái đậu tương. 6
1.1.5. Đặc tính của cây đậu tương. 6
1.1.5.1. Tính chịu lạnh. 6
1.1.5.2. Tính chịu hạn. 7
1.1.5.3. Tính chịu đựng và khả năng phục hồi 7
1.1.5.4. Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi 8
1.1.6. Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26. 8
1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam . 9
1.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 9
1.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 10
1.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật. 11
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens. 11
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid. 12
1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN 13
1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens. 14
1.3.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid. 14
1.3.6. Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc. 15
1.3.7. Hệ thống vector pCAMBIA 17
1.3.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens. 19
1.4. Cây trồng biến đổi gen và cây đậu tương biến đổi gen. 21
1.4.1. Cây trồng biến đổi gen trên thế giới và việt nam 21
1.4.2. Cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 22
Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu. 24
2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm 24
2.1.2. Hóa chất và môi trường. 24
2.1.3. Vi khuẩn. 24
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu. 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu. 24
2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng. 24
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. 24
2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương. 25
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26. 25
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của OD dịch khuẩn đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. 27
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen gus vào ĐT26. 29
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. 30
Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen. 32
Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0. 34
2.3. Các chỉ tiêu đánh giá. 35
Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng. 36
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. 36
3.2. Chuyển gen gus vào đậu tương. 38
3.2.1. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với ĐT26 38
3.2.2. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của OD dịch khuẩn đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. 40
3.2.3. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu suất chuyển gen gus vào ĐT26. 42
3.2.4. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. 44
3.2.5. Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen. 47
3.2.6. Thí nghiệm 7: Tách ADN và phân tích cây chuyển gen. 49
Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC 58
1. Môi trường MS (PH=5,6-5,8). 58
2. Môi trường LB (PH = 7). 58
3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu. 59