Luận Văn Xây dựng qui trình PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía

MỤC LỤC


PHẦN TRANG


LỜI CẢM TẠ .iv


TÓM TẮT v


SUMMARY vi


MỤC LỤC .vii


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT .x


DANH SÁCH CÁC BẢNG .xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH xii


Chương 1: MỞ ĐẦU .1


1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1


1.2. Nội dung nghiên cứu 2


1.3. Yêu cầu .2


1.4. Giới hạn đề tài 2


Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3


2.1. Sơ lược về cây mía .3


2.1.1. Lịch sử phát hiện .3


2.1.2. Phân loại 3


2.1.3. Nguồn gốc và phân bố .4


2.1.4. Nhân giống 5


2.1.5. Sản lượng .5


2.1.6. Chế biến và sử dụng 5


2.1.7. Vị trí kinh tế của cây mía 6


2.1.8. Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía .7


2.1.9. Bệnh trên cây mía 7


2.2. Bệnh than 8


2.2.1. Nguồn gốc và phân bố .8


2.2.2. Triệu chứng 9


2.2.3. Tác nhân gây bệnh .9


2.2.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh .10


2.2.5. Thiệt hại về kinh tế 11


2.2.6. Biện pháp phòng trừ 11


2.3. Các phương pháp xác định bệnh than 11


2.3.1. Dựa vào triệu chứng 11


2.3.2. Phương pháp chẩn đoán bằng cách nhuộm mắt mầm và soi dưới kính hiển vi


huỳnh quang. .12


2.3.3. Phương pháp ELISA .12


2.3.4. Phương pháp PCR .12


2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh than .21


2.4.1. Trên thế giới 21


2.4.2. Trong nước 23


Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24


3.1. Nội dung nghiên cứu 24


3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24


3.3. Vật liệu nghiên cứu .24


3.4. Phương pháp tiến hành .24


3.4.1. Phương pháp lấy mẫu 24


3.4.2. Phương pháp phân lập .25


3.4.3. Phương pháp tách đơn bào tử 25


3.4.4. Phương pháp nhân sinh khối nấm .26


3.4.5. Phương pháp ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea .26


3.4.6. Tinh sạch sản phẩm ly trích .28


3.4.7. Phương pháp PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea 29


Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32


4.1. Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea .32


4.1.1. Kết quả phân lập 32


4.1.2. Kết quả tách đơn bào tử .33


4.1.3. Kết quả nhân sinh khối 34


4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 36


4.2.1. Kết quả ly trích 36


4.2.2. Kết quả tinh sạch .37


4.3. Phát hiện DNA của Ustilago scitaminea bằng kỹ thuật PCR 39


Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .43


5.1. Kết luận .43


5.2. Đề nghị .43


TÀI LIỆU THAM KHẢO .44


PHỤ LỤC .47

DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG


Bảng 2.1: Thống kê các nhóm tác nhân gây bệnh và số lượng bệnh xảy ra


trên cây mía. 8


Bảng 2.2: Tỉ lệ nhiễm bệnh than của các giống mía ở Hawaii đối với nòi mới . 23


Bảng 3.1: Thành phần môi trường PGA* . 25


Bảng 3.2: Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt . 30


Bảng 4.1: Các dòng nấm được tách đơn bào tử 34


Bảng 4.2: Khối lượng sợi nấm sau 4 ngày lắc trong môi trường PGA* lỏng . 35


Bảng 4.3: Nồng độ các yếu tố trong phản ứng PCR thay đổi .40


DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG


Hình 2.1: Triệu chứng bệnh than trên mía 9


Hình 2.2: Bào tử nấm 10


Hình 4.1: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 5 ngày nuôi cấy .32


Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 7 ngày nuôi cấy .33


Hình 4.3: Bào tử nấm Ustilago scitaminea. .33


Hình 4.4: Bào tử nấm nảy mầm trên môi trường agar soi dưới kính hiển vi


ở vật kính x 40 34


Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc .35


Hình 4.6: Kết quả li trích DNA của 11 dòng nấm 36


Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch .38


Hình 4.8: DNA tổng số sau khi pha loãng 39


Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo quy trình của Albert, H. H., và Schenck, S., .39


Hình 4.10: Sản phẩm PCR sau thay đổi đầu tiên .40


Hình 4.11: Sản phẩm PCR sau khi thay đổi nồng độ hóa chất và chu kỳ nhiệt .41


Hình 4.12: Sản phẩm PCR theo quy trình mới .41