Thạc Sĩ Xây dựng hệ thống nuôi cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh hao

LỜI MỞ ĐẦU

Sốt rét, một trong những căn bệnh phổ biến nhất ở các nước nhiệt đới, gây ảnh hưởng đến 500 triệu người hàng năm và làm chết hơn một triệu người (WHO, 2004). Chính việc kháng lại thuốc quinoline của ký sinh trùng Plasmodium falciparum đã làm cho căn bệnh sốt rét ngày càng trở nên khó kiểm soát (Balint, 2001). Tuy nhiên, ngay nay artemisinin – được chiết xuất từArtemisia annua L. – đã trở nên phổ biến được xem như phương thức chữa sốt rét hữu hiệu và an toàn. Những nghiên cứu về cấu trúc phân tử cho thấy artemisinin là một sesquiterpene lactone, bên trong có cầu nối endoperoxide. Artemisinin và các dẫn xuất có khả năng chống lại các dòng Plasmodium falciparum kháng đa thuốc, chủ yếu là ở vùng Đông Nam Châu Á và gần đây là ở Châu Phi (Meshnick và cs., 1996).
Nguồn artemisinin hiện nay có được là từ việc thu nhận cây Thanh hao ngoài tự nhiên. Sản lượng artemisinin tùy thuộc từng mùa và tùy vào từng loại cá thể. Ngoài ra, côn trùng, nấm mốc, vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến hàm lượng và hoạt tính của artemisinin. Sự tổng hợp artemisinin ngoài cơ thể cũng đã được xem xét nhưng không hiệu quả do quá phức tạp, hàm lượng lại thấp do đó không đem lại hiệu quả kinh tế cao. Để giải quyết các vấn đề này, việc thu nhận artemisinin thông qua nuôi cấy mô thực vật đã được xem như giải pháp thay thế đầy hứa hẹn. Sự tổng hợp artemisinin in vitro đã được tìm thấy trong mô sẹo, tế bào dịch huyền phù và nuôi cấy rễ chuyển gen. Nuôi cấy rễ tóc chuyển gen là một hướng mới trong hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật, chúng thể hiện nhiều ứng dụng hứa hẹn trong tương lai hơn phương pháp nuôi cây tế bào và mô sẹo truyền thống. Điều này được thể hiện qua tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng tổng hợp các chất thứ cấp và có tính bền vững cao về mặt di truyền và sinh hoá. Agrobacterium chuyển gen tạo rễ tóc ở A. anua sản xuất artemisinin và gia tăng sinh khối hơn không chuyển gen nhiều, điều này đã làm cho chúng trở thành một hệ thống tốt để ngiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp.
Nhằm mục tiêu giải quyết phần nào tình trạng thiếu thuốc chữa trị sốt rét hiện nay,chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng hệ thống nuôi cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh hao (Artemisia annua. Linn)” Đề tài gồm những nội dung chính sau:
ü Thiết lập qui trình chuyển gen tạo rễ tóc ở cây Thanh hao
ü Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng
ü Nuôi cấy rễ tóc trên bioreactor ngập chìm tạm thời
ü Tách chiết hợp chất thứ cấp và sử dụng phương pháp TLC và HPLC để định tính và định lượng hàm lượng artemisinin trong rễ tóc.
Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện sinh học Nhiệt đới.

MỤC LỤC

Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục biểu đồ viii
Danh mục hình . ix
Danh mục ảnh x
Lời mở đầu . 1
1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét . 3
1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua 3
1.1.1.1. Hệ thống phân loại. . 3
1.1.1.2. Đặc điểm phân bố 3
1.1.1.3. Đặc điểm sinh thái 4
1.1.1.3.1. Điều kiện sống 4
1.1.1.3.2. Vòng đời . 4
1.1.1.4. Thành phần hóa học . 5
1.1.2. Tổng quan về bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị . 6
1.1.2.1. Sơ lược về bệnh sốt rét 6
1.1.2.2. Artemisinin công cụ chữa bệnh sốt rét hiện nay . 7
1.2. Sinh tổng hợp artemisinin 8
1.3. Tổng quan về chuyển gen tạo rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp. . 11
1.3.1. Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc 11
1.3.1.1. Giới thiệu . 11
1.3.1.2. Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ 12
1.3.1.3. Dùng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen vào thực vật 17
1.3.2. Nuôi cấy rễ chuyển gen và ứng dụng trong công nghệ nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp . 19
1.3.3. Các nguyên lý cơ bản nhằm làm gia tăng quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ chuyển gen 19
1.3.3.1. Chọn lọc dòng rễ có năng suất cao 20
1.3.3.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy 21
1.3.3.3. Elicitor 21
1.3.3.4. Nuôi cấy hai giai đoạn . 22
1.3.3.5. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. . 23
1.3.3.5.1. Khái niệm bioreactor . 23
1.3.3.5.2. Khó khăn và thuận lợi của nuôi cấy bằng hệ thống bioreactor 24
1.3.3.5.3. Phân loại bioreactor . 25
1.3.3.5.4. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ
chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. 26
1.4. Sắc ký lỏng cao áp HPLC 27
1.4.1. Nguyên tắc . 27
1.4.2. Thiết bị . 28
2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU . 29
2.1.1. Nguồn mẫu ban đầu 29
2.1.2. Môi trường nuôi cấy . 29
2.1.3. Dụng cụ thiết bị 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 29
2.2.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 29
2.2.1.1. Gieo hạt in vitro . 29
2.2.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc . 29
2.2.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 31
2.2.1.3.1. Tách chiết DNA thực vật . 31
2.2.1.3.2. Tách chiết plasmid DNA của Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325 . 31
2.2.1.3.3. Phân tích PCR kiểm tra quá trình chuyển gen . 32
2.2.1.4. Phân tích CĐHSTTV của rễ chuyển gen bằng phương pháp sinh trắc nghiệm 33
2.2.1.5. Định tính artemisinin trong rễ tóc bằng phương pháp TLC 36
2.2.1.5.1. Nguyên tắc . 36
2.2.1.5.2. Cách tiến hành . 37
2.2.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng lắc 38
2.2.2.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng và tích lũy artemisinin của rễ tóc 39
2.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đạm nitrat đến khả năng tích tụ artemisinin 39
2.2.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4 +/NO3 đến tích tụ artemisinin 40
2.2.2.4. Ảnh hưởng của photphat vô cơ đến khả năng tích tụ artemisinin . 40
2.2.2.5. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tích tụ artemisinin . 40
2.2.2.6. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tích tụ artemisinin 41
2.2.2.7. Môi trường cải tiến 41
2.2.3. Nuôi cấy rễ tóc Thanh hao trong bioreactor ngập chìm tạm thời . 41
2.2.3.1. Động thái tăng trưởng của rễ trong bioreactor ngập chìm tạm thời 42
2.2.3.2. Biến động pH của môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 42
2.2.3.3. Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 42
2.2.3.4. Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 42
2.2.3.5. Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 43
2.2.3.5.1. Chu kỳ ngập chìm trong nuôi cấy bioreactor . 43
2.2.3.5.2. Ảnh hưởng của YE và chitosan đến sự tích tụ artemisinin 43
2.2.4. Định lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC với bộ phản ứng sau cột và đầu dò UV 43
2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu 43
2.2.4.2. Định lượng artemisinin . 44
2.3. XỬ LÝ THỐNG KÊ 45
3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao . 46
3.1.1. Gieo hạt in vitro . 46
3.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 47
3.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen . 50
3.1.4. Đo hoạt tính CĐHSTTV 52
3.1.5. Định tính artemisinin . 54
3.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng . 55
3.3. Nuôi cấy rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 71
4.2. ĐỀ NGHỊ . 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC