Thạc Sĩ Xây dựng các thử nghiệm miễn dịch phát hiện protein e7 của human papilloamvirus type 18

LỜI MỞ ĐẦU
Nếu như cứ mỗi 3 phút có 1 người trên thế giới chết vì ung thư phổi thì cứ mỗi 2 phút có 1 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung. Ở Mỹ, trong năm 2009 ước tính có khoảng 12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung. Với tỉ lệ 26 ca trên 100.000 phụ nữ, ung thư cổ tử cung đã trở thành nguyên nhân ung thư gây tử vong hàng đầu cho phụ nữ ở Việt Nam cũng như các nước đang phát triển. Khuyến cáo ung thư cổ tử cung năm 2009 đã xác định phòng ngừa là chìa khóa then chốt trong cuộc chiến chống căn bệnh này. Do đó, một phương pháp tầm soát hiệu quả căn bệnh này sẽ giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ tử vong do nó gây ra.
Khoảng 95 % các trường hợp ung thư cổ tử cung là có liên quan đến Human papillomavirus (HPV). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có mối liên hệ mật thiết giữa việc nhiễm lâu dài một số chủng “có nguy cơ cao”, đặc biệt là HPV type 16 và HPV type 18, với khả năng phát triển bệnh ung thư cổ tử cung. Do đó, dựa vào mối quan hệ này, ta có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán để phát hiện sớm khả năng gây ung thư của HPV, từ đó đưa ra các phương pháp điều trị hiệu quả.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các công cụ miễn dịch dựa trên kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện protein E7 HPV 18, là một protein gây ung thư (oncoprotein) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ung thư của HPV. Các công cụ chẩn đoán này sẽ góp phần hoàn thiện công tác phòng ngừa và điều trị ung thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên thế giới.
MỤC LỤC

MỤC LỤC I
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT IV
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ V
DANH MỤC CÁC BẢNG VII
LỜI MỞ ĐẦU . VIII
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1. UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMAVIRUS 1
1.1.1. Ung thư cổ tử cung 1
1.1.2. Human papillomavirus (HPV) 2
1.2. PROTEIN E7 CỦA HPV VÀ UTCTC 4
1.2.1. Cấu trúc . 4
1.2.2. Vai trò của protein E7 trong UTCTC 5
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN UTCTC . 8
1.3.1. Các phương pháp dựa trên cơ sở tế bào học . 8
1.3.2. Các nghiên cứu phát hiện HPV dựa trên tương tác miễn dịch 9
1.4. KĨ THUẬT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (IMMUNOCYTOCHEMISTRY) 10
1.4.1. Khái niệm 10
1.4.2. Các bước cần lưu ý trong quy trình hóa tế bào miễn dịch 10
1.4.3. Các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch phát hiện UTCTC
1.5. KĨ THUẬT IMMUNO-PCR 15
1.5.1. Khái niệm 15
1.5.2. Nguyên lý 15
1.5.3. Các dạng immuno-PCR . 16
1.5.4. Ưu và nhược điểm của immuno-PCR . 22
1.5.5. Ứng dụng . 23
1.6. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG ĐỀ TÀI 24
2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 25
2.1. VẬT LIỆU 25
2.1.1. Dụng cụ - thiết bị . 25
2.1.1.1 Dụng cụ . 25
2.1.1.2 Thiết bị 25
2.1.2. Hóa chất – Môi trường 25
2.1.2.1 Hóa chất . 25
2.1.2.2 Môi trường . 28
2.1.3. Vật liệu 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 30
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật . 30
2.2.2. Phương pháp đếm tế bào bằng Trypan blue 30
2.2.3. Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật (transfection) . 31
2.2.4. Phương pháp lai hóa miễn dịch tế bào trên coverslip . 33
2.2.5. Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch trên lame kính 33
2.2.6. Phương pháp biotin hóa kháng thể 34
2.2.7. Phương pháp đánh giá mức độ biotin hóa kháng thể 34
2.2.8. Phương pháp tạo đoạn DNA đánh dấu biotin (DNA-biotin) 36
2.2.9. Xác định ái lực kháng thể bằng phương pháp ELISA trực tiếp . 36
2.2.10. Phương pháp ELISA ”kẹp chả” 37
2.2.11. Phương pháp checkerboard . 38
2.2.12. Phương pháp immuno-PCR 39
3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 41
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN PROTEIN E7 CỦA HPV 18 . 41
3.1.1. Khảo sát nồng độ kháng thể tối ưu cho quy trình . 41
3.1.2. Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 1D5 và 4H5 . 44
3.1.3. Khảo sát tác nhân bộc lộ kháng nguyên 46
3.1.4. Thử nghiệm quy trình trên mẫu tế bào xử lý theo phương pháp cytospin 47
3.1.5. Thử nghiệm quy trình trên các bệnh phẩm ung thư cổ tử cung 47
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNO-PCR PHÁT HIỆN PROTEIN E7 HPV 18 50
3.2.1. Biotin hóa kháng thể “phát hiện” 4H5 52
3.2.2. Tạo đoạn DNA đánh dấu biotin 53
3.2.3. Khảo sát nồng độ tối ưu của các thành phần trong quy trình immuno-PCR
3.2.3.1 Khảo sát nồng độ kháng thể “bắt giữ” và kháng thể “phát hiện” . 54
3.2.3.2 Khảo sát nồng độ DNA đánh dấu biotin . 57
3.2.3.3 Khảo sát nồng độ streptavidin (STV) 59
3.2.4. Khảo sát tác nhân “khóa” giếng 59
3.2.5. Độ nhạy của quy trình immuno-PCR trên E7 HPV 18 tái tổ hợp . 61
3.2.6. Độ đặc hiệu của quy trình immuno-PCR 64
4. KẾT LUẬN 66
5. ĐỀ NGHỊ 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 68
PHỤ LỤC . 76