Luận Văn Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Nội dung thực hiện 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana 3
2.1.1 Vị trí phân loại 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái 3
2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 4
2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy . 4
2.1.3.2 Điều kiện nhiệt độ 4
2.1.3.3 Điều kiện pH 4
2.1.4 Điều kiện phân bố . 4
2.1.5 Độc tố của nấm Beauveria bassiana . 5
2.1.6 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng . 6
2.1.6.1 Sự xâm nhập 6
2.1.6.2 Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết 6
2.1.7 Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm 7
2.1.8 Các chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana . 8
2.2 Tổng quan về ITS - rDNA . 9
2.2.1 Giới thiệu về rDNA và ITS 9
2.2.2 Phân nhóm rDNA 10
2.2.3 Sơ lược lịch sử nghiên cứu rDNA . 11
2.2.4 Sơ đồ vị trí và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu rDNA
và vùng ITS 12
2.2.4.1 Vị trí và trình tự primer khuếch đại nu-rDNA 12
2.2.4.2 Vị trí và trình tự primer khuếch đại mt-rDNA 13
2.2.5 Ý nghĩa của ITS - rDNA trong phân loại nấm . 14
2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR 15
2.3.1 Khái niệm . 15
2.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR . 15
2.3.3 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng 16
2.3.3.1 Primer và nhiệt độ lai . 16
2.3.3.2 DNA mẫu 16
2.3.3.3 Enzyme DNA polymerase . 16
2.3.3.4 dNTP . 17
2.3.3.5 Mg2+ và nồng độ Mg2+ 17
2.3.4 Những ứng dụng quan trọng của phản ứng PCR . 17
2.4 Nguyên tắc đọc trình tự . 18
2.4.1 Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger . 18
2.4.2 Nguyên tắc giải trình tự gen bằng máy sequencer . 18
2.4.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR . 18
2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm Beauveria bassiana 19
2.5.1 Nghiên cứu trong nước . 19
2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 22
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 22
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 22
3.2 Phân lập và nhân sinh khối các nguồn nấm Beauveria bassiana 23
3.2.1 Hóa chất và dụng cụ 23
3.2.1.1 Hóa chất 23
3.2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 23
3.2.2 Phương pháp phân lập nấm 23
3.2.3 Phương pháp nhân sinh khối 24
3.3 Khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria
bassiana có tính độc cao . 25
3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm dùng trong phản ứng PCR 25
3.3.1.1 Hóa chất 25
3.3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 25
3.3.2 Chuẩn bị khuôn DNA 26
3.3.3 Thành phần hóa chấ cho một phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt của
của phản ứng PCR 26
3.3.4 Đánh giá kết quả 27
3.3.5 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer
ITS4 và ITS5 27
3.3.6 Bố trí thí nghiệm trong phản ứng PCR 28
3.4 Đọc trình tự sản phẩm PCR . 29
3.4.1 Chuẩn bị DNA khuôn 29
3.4.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 29
3.4.1.2 Định lượng DNA đã được tinh sạch 30
3.4.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1
Sequencing Kit . 30
3.4.2.1 Thành phần hóa chất . 30
3.4.2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự . 31
3.4.3 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại . 31
3.4.4 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer 31
3.4.5 Quy trình tóm tắt các bước đọc trình tự 32
3.4.6 Bố trí thí nghiệm tinh sạch, đọc trình tự và phân tích kết quả 32
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và nhân sinh khối nấm trong môi trường CZA 34
4.2 Kết quả lio trích DNA tổng số các nguồn nấm Beauveria bassiana 35
4.3 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 . 37
4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 41
4.5 Kết quả đọc trình tự . 42
4.5.1 Kết quả đọc trình tự trên máy sequencer . 42
4.5.1.1 PUL-Q2-4 42
4.5.1.2 RN-LA-10 . 42
4.5.2 Kết quả tìm trình tự đáng tin cậy . 43
4.5.2.1 PUL-Q2-4 43
4.5.2.2 RN-LA-10 . 45
4.5.3 So sánh trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của PUL-Q2-4
và RN-LA-10 . 45
4.5.4 So sánh trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 với các nguồn
nấm Beauveria bassiana từ cơ sở dữ liệu NCBI 46
4.5.5 Biểu đồ phân nhánh . 49
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận . 50
5.2 Đề nghị 50
5.3 Giới hạn đề tài . 51
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 52
PHỤ LỤC . 57