Luận Văn Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề:
Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thủy cầm, đặc biệt là ở gà do virus cúm type A thuộc họ Orthomysoviride gây nên. Trong các phân type cúm A thì phân type H5N1 là phân type có độc lực cao nhất và gây chết gia cầm hàng loạt, gây thiệt hại rất lớn cho con người và kinh tế.
Năm 1997 dịch cúm bùng phát tại Hồng Kông sau đó lan sang các nước châu Á, châu Âu, châu Phi. Theo tổ chức y tế thế giới (OIE) có 55 quốc gia trên thế giới nhiễm dịch cúm A/H5N1 tính từ năm 2003 [12]. Và ở việt Nam, dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện là vào tháng 2 năm 2003 và chỉ trong thời gian ngắn đã lây lan ra 57 tỉnh thành trên cả nước gây thiệt hại lớn cho nghành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng tới nhiều mặt của đời sống kinh tế, xã hội. Theo Cục Thú y, trong năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện tại 64 xã, phường của 38 huyện 23 tỉnh, thành trên cả nước. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là hơn 147 nghìn con, trong đó chủ yếu là vịt. Đáng lo ngại là tại khu vực Đồng bằng Bắc bộ, nơi chăn nuôi số lượng lớn gia cầm đã tái phát dịch cúm tại tỉnh Nam Định, tỉnh Nghệ An cũng đã có loại dịch bệnh nguy hiểm này. So với năm 2009, thì năm 2010, số địa phương xuất hiện dịch cao hơn, trong đó có đến 11 tỉnh xuất hiện dịch 2 năm liền [6]. số ổ dịch của năm 2010 thấp hơn nhưng số tỉnh có dịch cao hơn, cho thấy sự phân bố về mặt không gian của các ổ dịch phân tán hơn. Trong thời gian từ năm 2003 đến 2010, toàn quốc có 119 ca nhiễm cúm A/H5N1 trên người, trong đó có 59 ca tử vong. Hiện nay, cả nước còn 3 tỉnh là Lạng Sơn, Nam Định và Kon Tum có dịch cúm gia cầm [1].
Do virus cúm gia cầm H5N1 có tốc độ tiến hóa nhanh, có độc lực cao và rất dễ lây lan bùng phát thành dịch lớn. Bên cạnh đó các biện pháp phòng, chống dịch đặc biệt là nhận thức của người chăn nuôi về tính chất nguy hiển của dịch cúm còn rất hạn chế, tỷ lệ tiêm vacine cúm gia cầm còn thấp Chính vì vậy vấn đề nghiên cứu và sản xuất vacine phòng chống cúm gia cầm là vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết.
Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài “Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam”. Đề tài góp phần ứng dụng vào việc sản xuất vacine cúm A/H5N1, phòng bệnh trên gia cầm tại Việt Nam.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN!
MỞ ĐẦU: CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1 Giới thiệu chung về dịch cúm gia cầm . 3
1.1.1. Lịch sử cúm gia cầm 3
1.1.2. Nguồn lây nhiễm cúm A/H5N1 . 3
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng 5
1.1.4. Tình hình dịch bệnh 6
1.1.4.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới 6
1.1.3. Tình hình dịch cúm ở Việt Nam 8
1.2. Virus cúm A . 12
1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc 12
1.2.2. Cấu trúc hệ gen và chức năng 13
1.2.3. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm A . 16
1.3. Một số phương pháp phòng, chống bệnh cúm A/H5N1.: . 17
1.3.1. Phòng bệnh bằng vaccine 17
G 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu: 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20
2.1.2. Các hoá chất dùng trong nghiên cứu . 20
2.1.3. Các trang thiết bị: 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số 20
2.2.2. Kiểm tra RNA trên quang phổ kế . 21
2.2.4. Nhân bản gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 bằng phương pháp PCR 22
2.2.5. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di . 23
2.2.6. Phương pháp tách dòng 24
2.2.7. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào E.coli chủng INV αF` . 24
2.2.8. Tách chiết DNA plasmit 25
2.2.9. Tinh sạch plasmit 26
2.2.10. Xác định trình tự gen bằng máy tự động . 27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29
3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 29
3.2. Kết quả khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm H5N1. 30
3.3. Kết quả tách dòng sản phẩm PCR . 31
3.3.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vecto pCR[SUP]R[/SUP] 2.1 32
3.3.2. Biến nạp vecto tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng INV αF’. 33
3.3.3. Tách chiết plasmit . 34
3.3.4. Kiểm tra vecto tái tổ hợp bằng cắt với enzyme giới hạn EcoR I 35
3.5. Kết quả xác định trình tự . 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 40
KẾT LUẬN . 40
ĐỀ NGHỊ: . 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 41