Luận Văn XÁC ĐỊNH SỰ HOẠT HÓA CỦA PHOSPHATIDYLINOSITOL 4-PHOSPHATE 5-KINASE (PIP5K) A VÀ C661 TRÊN DÒNG TẾ BÀ

NGÔ THÁI BÍCH VÂN


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phosphatidylinositol 4 phosphate 5 kinase (PIP5K). 2
1.1.1. Cấu trúc của PIP5K. . 2
1.1.2. Quá trình tổng hợp PIP2 của PIP5K trong tế bào. . 3
1.1.3. Protein PIP5KA. . 5
1.1.4. Protein PIP5KB 6
1.1.5. Protein PIP5KC 7
1.1.6. Các nhân tố hoạt hóa PIP5K 8
1.2. Protein kinesin KIF2A . 9
1.2.1. Họ protein kinesin (KIFs) 9
1.2.2. Protein KIF2A 11
1.3. Phức hợp adaptor protein AP-2 . 12
1.3.1. Cấu trúc của protein AP-2 12
1.3.2. AP-2 là protein tương tác đặc hiệu với PIP5KC661. . 13
1.4. Hệ thống bổ trợ huỳnh quang hai phân tử Split Venus. 15
1.4.1. Hệ thống bổ trợ huỳnh quang hai phân tử (Bimolecular Fluorescence
Complementation – BiFC). 15
1.4.2. Hệ thống Split Venus . 16
Mục tiêu và nội dung thực hiện 17
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.VẬT LIỆU 18
2.1.1.Dụng cụ - Thiết bị . 18
2.1.1.1.Dụng cụ 18
2.1.1.2.Thiết bị . 18
2.1.2.Hóa chất – Môi trường 18
2.1.2.1.Hóa chất 18
2.1.2.2.Môi trường . 21
2.1.3.Nguyên vật liệu . 22
2.1.3.1.Tế bào . 22
2.1.3.2.Chủng vi sinh vật . . 22
2.1.3.3. Các plasmid sử dụng trong luận văn . 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 24
2.2.1. Phương pháp thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng
PCR 24
2.2.1.1. Đặc điểm cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR 24
2.2.1.2. Phản ứng PCR . 25
2.2.2.Tạo dòng trình tự mã hóa vùng hình cầu của protein KIF2A. 26
2.2.2.1.Xử lý sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và plasmid pVenus-N1
bằng enzyme XhoI và EcoRI 26
2.2.2.2.Tinh sạch sản phẩm cắt bằng bộ kit gel M . 27
2.2.2.3.Thiết lập phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp. . 28
2.2.2.4.Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α. 28
2.2.2.5. Thu nhận dòng tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp pVenus-KIF2AGD
29
2.2.3. Tạo dòng trình tự mã hóa vùng ear của protein β2-Adaptin-ear 31
2.2.4. Tách chiết lượng lớn plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit Midiprep
(Quiagen) 31
2.2.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật. . 32
2.2.5.1. Phương pháp cấy chuyền tế bào. . 32
Mục lục
lxxv
2.2.5.2. Bảo quản tế bào nuôi cấy 33
2.2.6. Kiểm tra sự biểu hiện protein KIF2A-GD và protein β2-Adaptin-ear . 34
2.2.6.1. Phương pháp chuyển DNA vào tế bào động vật bằng
Lipofectamine . 34
2.2.6.2. Phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa invitro bằng phương pháp
kính hiển vi huỳnh quang. 37
2.2.6.3. Xác định tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang. 37
2.2.6.4. Kiểm tra sự tái sắp xếp của actin trong tế bào 37
2.2.6.5. Xác định cường độ tín hiệu huỳnh quang bằng phần mềm Image J
Basics (NIH). 38
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dòng và kiểm tra trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A
(KIF2A-GD) và vùng ear của protein β2-Adaptin (β2-Adaptin-ear) . 39
3.1.1. Thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng phương pháp
PCR. . 39
3.1.2. Dòng hóa cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector pVenus
(1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. 40
3.1.3. Kết quả giải trình tự . 42
3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống
Split Venus. . 46
3.2.1. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. . 46
3.2.2. Kết quả xác định hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid . 50
3.3. Xác định sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trên dòng tế bào HeLa
clone 3. 51
3.3.1. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi được kích thích
bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF. 52
3.3.2. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi protein ARF6 QL
biểu hiện vượt mức . 53
3.3.2. Kết quả định lượng cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa
clone 3 55
Chương 4: KẾT LUẬN
KẾT LUẬN 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC