Luận Văn Xác định quy trình ly trích dna từ lông heo

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO” được tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Hướng dẫn đề tài: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu cơ đã trở nên quen thuộc trong các thí nghiệm sinh học phân tử trước đây và hiện nay. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự, trong khảo cổ học, hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm, ta chỉ có được mẫu lông hay tóc. Do đó, việc lấy mẫu lông hay tóc và ly trích DNA từ loại mẫu này trở nên rất cần thiết trong những trường hợp này. Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác (như máu, da, cơ ) trên thú sống. Chúng ta có thể nhổ hoặc cắt một vài lông trên thú một cách dễ dàng mà không phải giết mổ hay gây ra stress cho thú sống. Việc ly trích DNA từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tương tự lông như móng, mỏ, da, xương Với mục đích tìm một quy trình tối ưu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, từ nhiều vị trí trên sợi lông và xác định sự xuất hiện của gen halothane, đề tài được tiến hành trên lông heo. Kết quả ly trích được đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt được như sau: 1. Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lượng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84. 2. DNA được ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi được dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR.
3. Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại được gen halothan ở nồng độ CTAB 0,2%. 4. Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75) và vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông.
MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt khóa luận v
Mục lục . vii
Danh sách các chữ viết tắt . x
Danh sách các bảng . xi
Danh sách các hình và biểu đồ . xii
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu 2
1.2.1. Mục tiêu . 2
1.2.2. Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
2.1. Cấu trúc của lông 3
2.1.1. Cấu trúc tổng quan . 3
2.1.2. Cấu trúc của melanin . 4
2.1.3. Cấu trúc của keratin . 4
2.1.4. Các liên kết trong lông 5
2.1.4.1. Liên kết cuộn xoắn A . 5
2.1.4.2. Liên kết trong protein keratin . 6
2.1.4.3. Liên kết hydrogen . 6
2.1.4.4. Liên kết muối 6
2.1.4.5. Liên kết cystine . 6
2.1.4.6. Liên kết đường 6
2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông heo 6
2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông . 7
2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nước ngoài . 7
viii
2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nước 9
2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) . 10
2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của PCR 10
2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR . 10
2.4. Gen halothane . 11
2.4.1. Khái quát về gen halothane . 11
2.4.2. Ảnh hưởng của gen halothane . 12
2.4.2.1. Ảnh hưởng của gen halothane đến năng suất sinh sản . 12
2.4.2.2. Ảnh hưởng của gen halothane đến sinh trưởng và phẩm chất thịt . 13
2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane 13
2.5.1. Nguyên tắc xác định gen halothane . 13
2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở nước ngoài . 14
2.5.3. Những công trình nghiên cứu halothane trong nước . 14
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Nội dung nghiên cứu 16
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 16
3.3. Vật liệu . 16
3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA 16
3.3.2. Đoạn mồi . 16
3.3.3. Hóa chất . 16
3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài 17
3.3.4.1. Dụng cụ . 17
3.3.4.2. Thiết bị 17
3.4. Phương pháp tiến hành . 18
3.4.1. Lấy và trữ mẫu . 18
3.4.2. Tách chiết DNA . 19
3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo 19
3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo 20
3.4.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 21
ix
3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 21
3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 22
3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose . 22
3.4.5.2. Đọc kết quả 22
3.5. Xử lý số liệu . 22
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 23
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K . 23
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT 26
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB . 27
4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí lông heo . 29
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30
5.1. Kết luận . 30
5.2. Đề nghị . 30
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 31