Tiểu Luận Xác định phân tử lượng và các thông số động học của urease từ đậu nành hạt vàng việt nam

1. MỞ ĐẦU
Urease là một loại enzym thuỷ phân ure hình thành NH3 và CO2, được ứng dụng rất nhiều
trong y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong các mẫu bệnh phẩm và nước
chấm. Trên thế giới, có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về enzym urease và và các đặc tính
của chúng, tuy nhiên các bài nghiên cứu về urease từ các nguồn nguyên liệu đậu khác nhau cho
các kết quả khác nhau về đặc tính urease. Điều này chứng tỏ urease từ các nguyên liệu đậu khác
nhau có thể có một số khác biệt về tính chất. Còn ở Việt Nam chỉ mới có các nghiên cứu để tinh
sạch urease, hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu nào về các đặc tính urease từ nguyên liệu
đậu nành Việt Nam.
Để có thể ứng dụng urease trong y học và Thực Phẩm hiệu quả rất cần thiết phải nắm được
các đặc tính urease.ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài
với giá thành rất cao. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một số đặc tính urease đậu
nành hạt vàng Việt Nam: phân tử lượng của urease và chuỗi tiểu đơn vị, các thông số động học
của urease.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
Urease đậu nành hạt vàng Việt Nam: được tinh sạch qua các công đoạn: trích ly với dệm
phosphate pH 7, 1/15M chứa 0,05M EDTA và 0,05M L-cystein; tủa phân đoạn sunfat amon 65%
và 55% bão hòa; trao đổi ion trên DEAE – cellulose; đông khô bảo quản dưới dạng bột trắng,
mịn.
Hoá chất: dãy protein chuẩn 10 000 – 250 000 Da và 35 000 – 400 000 Da, Nessler (Merck),
Glycine, Tris(base), EDTA, L-Cystein.HCl, Acrylamide và bisacrylamide, SDS, TEMED,
Amonium persulfate, DEAE – Cellulose (Merck).
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease [4]
Phương pháp điện di: điện di trên gel 7,5% và 10% polyacrylamid với tốc độ dòng 20mA, gel
được nhuộm với Coomassie Blue R-250. [1]
Xác định phân tử lượng của urease: lập đồ thị đường chuẩn biểu hiện sự tương quan giữa
phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển của chúng khi điện di trên gel polyacrylamyd.
Từ khoảng di chuyển của urease, bằng phương trình đường chuẩn trên chúng tôi sẽ xác định được
phân tử lượng của urease. [19]
Xác định vận tốc phản ứng thuỷ phân ure của enzym urease: dựa vào lượng NH3 hình thành
xác định bằng phương pháp Nessler, từ đó tính được lượng ure phân huỷ theo thời gian.
3. KẾT QUẢ
3.1 Xác định phân tử lượng của urease đậu nành:
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel poliarylamid 7,5% để
xác định phân tử lượng các mẫu urease đậu nành hạt vàng Việt Nam đã tinh sạch. Trong đệm mẫu
chúng tôi không sử dụng SDS và b -mercaptoethanol nhằm giữ nguyên phân tử lượng urease
chạy trong điện trường điện di. Để so sánh chúng tôi dùng các chất chuẩn có phân tử lượng từ 35
000 – 400 000 Da. Mẫu enzym urease hoà tan trong đệm mẫu, xử lý nhiệt, sau đó qua điện di trên
gel polyacrylamid 7,5% với đệm điện di cũng không bổ sung SDS. Theo [19] muốn xác định
phân tử lượng của một chất thông qua các chất chuẩn trên gel polyacrylamide trước hết phải lập
phương trình đường chuẩn với các thông số tương quan tuyến tính là phân tử lượng của dãy chất
chuẩn cà khoảng cách di chuyển của chúng trên điện di đồ. Trong thí nghiệm chúng tôi xác lập
phương trình đường chuẩn với dãy protein chuẩn có phân tử lượng từ 35 000 – 400 000 Da. Kết
quả ở hình 1 và bảng 1.