Luận Văn xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi Gà một lớp và thử nghiêm nuôi c

Đề tài: xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi Gà một lớp và thử nghiêm nuôi cấy VIRUS NEWCASTLE


TÀI LIỆU THAM KHẢO DÀI 66 TRANG GỒM MỤC LỤC :


Trang phụ bìa .i
Trang duyệt .ii
LỜI CAM ĐOAN . iii
LỜI CẢM TẠ iv
TÓM LƯỢC v
MỤC LỤC .vi
Danh mục hình .ix
Danh mục bảng .x
Danh mục chữ viết tắt .xi
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2
2.2 Cấu tạo của tế bào động vật . 3
2.3 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy 4
2.3.1 Sự điều hòa trao đổi chất . 4
2.3.2 Tính chất cơ học yếu . 4
2.3.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng chậm 5
2.3.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi 5
2.3.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng 5
2.3.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ . 5
2.3.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo . 5
2.4 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 6
2.4.1 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật .6
2.4.2 Các dòng tế bào nuôi cấy (Cell line) 6
2.4.3 Dụng cụ nuôi cấy tế bào 6
2.4.4 Một số môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà . 7
2.5 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật .8
2.5.1 Nhiệt độ ủ ấm .8
2.5.2 Chỗ bám (giá đỡ) 8
2.5.3 Môi trường nuôi cấy 8
2.5.4 Các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy 9
2.6 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy 10
2.7 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật . 10
2.8 Các pha trong nuôi cấy tế bào động vật 11
2.8.1 Pha ức chế (lag phage) 11
2.8.2 Pha phát triển (log phage) . 12
2.8.3 Pha ổn định (stationary phage) 12
2.8.4 Pha suy giảm (decline phage) 12
2.9 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 12
2.10 Nuôi cấy và thu nhận virus trên tổ chức tế bào . 13
2.10.1 Lịch sử nuôi cấy và thu nhận virus 13
2.10.2 Định nghĩa và đặc tính chung của virus . 13
2.10.3 Mối quan hệ giữa virus và tế bào vật chủ - sự nhân lên của virus . 14
2.10.3.1 Giai đoạn virus hấp phụ trên bề mặt tế bào . 14
2.10.3.2 Giai đoạn virus xâm nhập vào tế bào 14
2.10.3.3 Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virus 14
2.10.3.4 Giai đoạn lắp ráp, hình thành các hạt virus . 15
2.10.3.5 Giai đoạn phóng thích virus ra bên ngoài tế bào 15
2.10.4 Nuôi cấy và thu nhận virus trên môi trường tế bào CEF 15 vii

2.10.4.1 Nuôi cấy virus 15
2.10.4.2 Thu nhận virus . 16
2.10.5 Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường tế bào
lớp đơn 16
2.10.6 Virus Newcastle (NDV-Newcastle Disease Virus) 17
2.10.6.1 Hệ thống phân loại . 17
2.10.6.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle 17
2.10.6.3 Tính chất sinh học của virus Newcastle 18
2.10.6.4 Sức đề kháng 18
2.10.6.5 Chẩn đoán virus Newcastle ở phòng thí nghiệm . 19
2.10.6.6 Nuôi cấy virus Newcastle trong phòng thí nghiệm 19
CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1 Thời gian và địa điểm 20
3.1.1 Thời gian 20
3.1.2 Địa điểm . 20
3.2 Vật liệu và hóa chất . 20
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 20
3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 20
3.2.3 Các hoá chất và môi trường . 21
3.3 Nội dung nghiên cứu 22
3.4 Phương pháp nghiên cứu 22
3.4.1 Xây dựng quy trình tạo môi trường tế bào xơ phôi gà (CEF) một lớp 22
3.4.1.1 Phương pháp tạo môi trường CEF một lớp . 22
3.4.1.2 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí
nghiệm . 23
3.4.1.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ L-Glutamine khi bổ sung
vào môi trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào . 24
3.4.1.4 Quy trình tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp . 25
3.4.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập virus Newcastle trong môi trường tế bào xơ
phôi gà một lớp 26
3.4.2.1 Phương pháp tạo nguồn virus Newcastle 26
3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy và thu nhận virus Newcastle trong môi trường tế bào xơ
phôi gà một lớp 26
3.4.3.3 Sơ đồ quy trình nuôi cấy, tăng sinh và thu nhận virus Newcastle trên môi
trường tế bào CEF 28
3.4.4 Phương pháp pha loãng và chuẩn độ virus Newcastle vào môi trường tế bào xơ
phôi gà một lớp 29
3.4.4.1 Pha loãng virus . 29
3.4.4.2 Chuẩn độ virus . 29
3.4.4.3 Cách xác định chỉ số TCID50 dựa vào CPE .29
3.4.5 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả tăng sinh NDV qua 2 lần cấy truyền trên môi
trường CEF 30
3.4.6 Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red
và Crystal violet trong quan sát CPE và tính chỉ số TCID50 30
3.4.6.1 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Neutral red . 30
3.4.6.2 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Crystal violet 30
3.4.6.3 Sơ đồ quy trình nhuộm tế bào bằng hai loại thuốc nhuộm Neutral red và
Crystal violet . 31
3.4.6.4 Bố trí thí nghiệm 32
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 viii

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm . 33
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ L-Glutamine khi bổ sung vào môi
trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào 37
4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả tăng sinh NDV qua 2 lần cấy truyền trên môi trường
CEF . 40
4.4 Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red và
Crystal violet trong quan sát CPE và tính chỉ số TCID50 41
4.5 Xác định chỉ số TCID50 dựa vào CPE 43
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1 Kết luận . 44
5.2 Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .45