Luận Văn Xác định gene liên quan đến tính kháng virus PMWaV – gây bệnh héo đỏ đầu lá trên giống dứa Cayenne b

MỤC LỤC


LỜI CẢM TẠ iii


TÓM TẮT . iv


MỤC LỤC v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH x


DANH SÁCH CÁC BẢNG . xii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xii


MỞ ĐẦU 1


1.1. Đặt v́n đề . 1


1.2. Mục tiêu 3


1.3. Nội dung 3


1.4. Yêu cầu 3


TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4


2.1. Tổng quan về cây dứa . 4


2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 4


2.1.2. Đặc điểm thực vật học 4


2.1.3. Cây dứa Cayenne . 5


2.1.4. Tình hình sản xút và tiêu thụ dứa trên thế giới và Việt Nam . 7


2.2. Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa . 8


2.2.1. Tình hình dịch bệnh và tác hại . 8


2.2.2. Triệu chứng 9


2.2.3. Nguyên nhân gây bệnh . 10


2.2.4. Tác nhân lây truyền bệnh . 10


2.2.5. Cách phòng trừ . 11


2.2.6. Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và Việt Nam 11


2.3. Tổng quan vế tính kháng bệnh trên thực vật . 13


2.3.1. Khái niệm về tính kháng bệnh trên thực vật 13


2.3.2. Cơ sở sinh hóa, sinh lý của tính kháng bệnh ở thực vật . 14


2.3.3. Cơ sở di truyền tính kháng bệnh ở thực vật . 16


2.3.4. Phân loại tính kháng bệnh của cây trồng . 18


2.3.5. Khái niệm gene đối gene (gene - for - gene concept) 19


2.3.6. Chức năng và ću trúc gene kháng 20


2.4. Phương pháp PCR thoái hoá trong nghiên cứu tính kháng thực vật . 24


2.4.1. Một số chiến lược nghiên cứu tính kháng thực vật 24


2.4.2. Sơ lược về quá trình sử dụng phương pháp PCR thoái hoá . 25


2.4.3. Thiết kế primer thoái hoá . 27


2.4.4. Những khuyết điểm của phương pháp . 31


2.5. Ly trích DNA thực vật 31


2.6. Định lượng DNA . 32


2.7. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 32


2.7.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 32


2.7.2. Thành phần và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR . 35


2.8. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền 36


2.9. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 37


2.9.1. Enzyme cắt giới hạn . 37


2.9.2. Nguyên tắc của phương pháp RFLP 37


VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 39


3.1. Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu . 39


3.1.1. Nội dung . 39


3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39


3.2. Vật liệu 39


3.2.1. Vật liệu chủng bệnh . 39


3.2.2. Hoá ch́t và vật liệu dùng trong li trích DNA tổng số và PCR 40


3.3. Phương pháp nghiên cứu . 41


3.3.1. Nội dung 1: Lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne. . 41


3.3.2. Nội dung 2: Phân lập vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập. 44


3.3.3. Nội dung 3: Phân tích RFLP vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập. 49


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 50


4.1. Nội dung 1: Lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne. 50


4.1.1. Nuôi rệp 50


4.1.2. Lây nhiễm bệnh 51


4.1.3. Thu thập mẫu 54


4.2. Nội dung 2: Phân lập vùng gene NBS trên các mẫu dứa thu thập 56


4.2.1. Kết quả ly trích DNA tổng số 56


4.2.2. Kết quả pha loãng mẫu DNA tổng số 56


4.2.3. Tối ưu phương pháp PCR thoái hoá . 57


4.2.4. Reamplify sản phẩm PCR 64


4.2.5. PCR trên các loại mô khác nhau 65


4.2.6. PCR thoái hoá clone vùng NBS trên các mẫu dứa Cayenne . 66


4.3. Nội dung 3: Phân tích RFLP vùng gene NBS các mẫu dứa thu thập. 68


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69


5.1. Kết luận . 69


5.2. Đề nghị 69


TÀI LIỆU THAM KHẢO 70


DANH SÁCH CÁC HÌNH


Hình 2.1. Cây dứa 5


Hình 2.2. Cây dứa Cayenne . 6


Hình 2.3. Ruộng dứa bị nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá 8


Hình 2.4. Cây dứa và quả dứa Cayenne bị nhiễm bệnh đỏ đầu lá do virus PMWaV.9


Hình 2.5. Hai loại rệp lây truyền PMWaV. . 10


Hình 2.6. Sự cộng sinh giữa kiến và rệp sáp 11


Hình 2.7. Cơ chế kích hoạt tính kháng bệnh ở thực vật . 20


Hình 2.8. Một số domain kháng, sự tổ hợp và phân bố của chúng trong tế bào 22


Hình 2.9. Tương quan về sự bảo tồn và biến dị của ću trúc NBS-LRR . 23


Hình 2.10. Sự phân bố và bảo tồn của các motif trong vùng . 24


Hình 2.11. Tiến trình nghiên cứu tính kháng thực vật có sử dụng phương pháp PCR


thoái hoá. 27


Hình 2.12. Sơ đồ các bước thết kế primer thoái hoá và bảng mã các nucleotide thoái


hóa. . 29


Hình 2.13. Quá trình của phản ứng PCR. 34


Hình 3.1. Chuyển rệp lên bí . 42


Hình 3.2. Chuyển rệp bằng đèn 43


Hình 4.1. Sự phát triển của rệp trên bí đỏ sau 45 ngày. . 51


Hình 4.2. Rệp phát triển trên dứa sau 7 ngày . 52


Hình 4.3. Chuyển rệp lên dứa sạch bệnh. 53


Hình 4.4. Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng 53


Hình 4.5. Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá sau khi chủng bệnh. . 54


Hình 4.6. Một số mẫu dứa Cayenne thu thập . 55


Hình 4.7. Kết quả điện di DNA tổng số theo quy trình cải tiến . 56


Hình 4.8. Kết quả pha loãng DNA. 57


Hình 4.9. Kết quả PCR tối ưu 4 cặp primer theo quy trình của Z. Deng và cs có cải


tiến 58


Hình 4.10. Kết quả PCR tối ưu nồng độ primer 59


Hình 4.11. Kết quả PCR tối ưu nồng độ dNTP 60

Hình 4.12. Kết quả PCR tối ưu nồng độ Mg2+ . 61


Hình 4.13. Kết quả PCR tối ưu nồng độ Taq polymerase . 62


Hình 4.14. Kết quả tối ưu nhiệt độ bắt cặp 62


Hình 4.15. Kết quả PCR tối ưu số chu kỳ 63


Hình 4.16. Kết quả khuếch đại lại sản phẩm PCR lần 1 của một số mẫu dứa . 65


Hình 4.17. Sản phẩm PCR với quy trình đã tối ưu trên các loại mô khác nhau 66


Hình 4.18. Kết quả PCR thoái hoá trên 9 mẫu dứa Cayenne . 67


Hình 4.19. Kết quả phân cắt enzyme Hind III sản phẩm PCR thoái hoá . 68