Luận Văn Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng phản ứng Multiplex PCR

Đồ án tốt nghiệp
Đề tài: Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng phản ứng Multiplex PCR


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 4
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 4
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước . 6
1.2. Đặc tính củavi khuẩn C.perfringens 7
1.2.1. Đặt điểm hình thái và tính bắt màu 8
1.2.2. Đặt tính nuôi cấy . 8
1.2.3. Đặt tính sinh vật, hóa học 9
1.2.4. Đặt tính di truyền . 10
1.3. Các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens 11
1.3.1. Alpha toxin (CPA) . 11
1.3.2. Beta toxin (CPB) . 12
1.3.3. Epsilon toxin (ETX) 12
1.3.4. Iota toxin (CPI) 13
1.3.5. Enterotoxin (CPE) . 13
1.3.6. Delta toxin . 13
1.3.7. Theta toxin 13
1.4. Các type độc tố của vi khuẩn C.perfringens và khả năng gây bệnh 14
1.4.1 Type A . 15
1.4.2. Type B . 15
1.4.3. Type C . 16
1.4.4. Type D . 17
1.4.5. Type E . 17
1.5. Phản ứng PCR . 18
1.5.1. Nguyên tắc thực hiện . 18
iii
1.5.2. Các thành phần cơ bản tham gia phản ứng PCR . 19
1.5.3. Các bước tiến hành 21
1.5.4. Phân tích kết quả . 22
1.5.5. Các yếu tố ảnh hưởng 23
1.5.6. Phản ứng Multiplex PCR . 26
1.5.7. Những lợi ích của phản ứng PCR . 26
1.5.8. Các loại PCR . 27
1.5.9. Giải pháp tối ưu hóa PCR 28
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .30
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU . 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.2.1. Kiểm tra đặt tính sinh học, hóa học 30
2.2.2. Xác định gen mã hóa độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 32
2.2.3. Phương pháp thử độc lực . 35
2.3. TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM . 37
2.4. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 37
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 37
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. GIÁM ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 38
3.2. Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR . 42
3.2.1. Xác định type độc tố 42
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa độc tố đươngruột và beta2 . 44
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG 46
3.3.1. Độc lực của canh khuẩn trên chuột nhắt trắng 46
3.3.2. Độc lực của độc tố trên chuột nhắt trắng 47
3.4. Xác định MLD của độc tố vi khuẩn . 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
1. KẾT LUẬN 50
2. ĐỀ NGHỊ . 50
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens . 11
Bảng 2.2 : Các type vi khuẩn C. perfringensvà độc tố chính . 14
Bảng 2.3: Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens 14
Bảng 2.1: Trình tự các mồi (primer) được sử dụng trong Mutiplex –PCR 33
Bảng 2.2: Các thành phần của phản ứng Multiplex –PCR 34
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex –PCR 35
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra đặc tính sinh học, hóa học 39
Bảng 3.2: Kết quả xác định type loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens 43
Bảng 3.3: Kết quả xác định gen mã hóa độc tố Beta2 toxin và Enterotoxin . 44
Bảng 3.5:Kết quả kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm độc tố type A 47
Bảng 3.6:Kết quả kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm độc tố type D 47
Bảng 3.7:Kết quả xác định MLD của độc tố trên chuột 48
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Vi khuẩn C. perfringens . 7
Hình 2.2. Hiện tượng dung huyết beta . 8
Hình 2.3.Phản ứng PCR 17
Hình 2.4.Chu trình nhiệt PCR . 18
Hình 3.1. Phương pháp tiêm canh khuẩn vào xoang phúc mạc . 34
Hình 3.2. Phương pháp tiêm độc tố vào tĩnh mạch đuôi chuột . 35
Hình 4.1.Hình thái vi khuẩn, trực khuẩn Gram dương . 38
Hình 4.2.Hình thái vi khuẩn, phương pháp soi tươi . 38
Hình 4.3.Dung huyết beta trên môi trường thác máu . 39
Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường SPS . 39
Hình 4.5.Trên môi trường Egg yolk 39
Hình 4.6.Trên Litmus . 39
Hình 4.7.Môi trường đường chưa nuôi cấy 39
Hình 4.8.Manitol -, Glucose + , Lactose + , Maltose + , Sucrose + 39
Hình 4.9.Phản ứng CAMP 40
Hình 4.10.Phản ứng O-F . 40
Hình 4.11.Kết quả xác định gen mã hóa các loại độc tố bắng phản ứng multiplex
PCR . 43
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm qua, nhờ chính sách đầu tư phát triển Nông nghiệp, xóa đói
giảm nghèo của Chính phủđã thúc đẩy nghề chăn nuôi nói chung và chăn nuôi dê,
cừu nói riêng phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng. Tổng đàn dê, cừu cả
nước tăng từ 572.448 con năm 2001lên đến 1.777.600 con năm 2007, trong đó 3
tỉnh duyên hải Nam Trung bộ (Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận) chiếm
15,87% (khoảng 282.125 con). Tuy nhiên, việc thực hiện các quy trình kỹ thuật như
quản lý giống, chuồng trại, thú y, chăm sóc nuôi dưỡng của các địa phương còn
nhiều hạn chế, trình độ kỹ thuật và quản lý còn yếu kém. Bên cạnh đó việc nghiên
cứu về thức ăn, chăm sóc nuôi dưỡng, phòng trị bệnh tật cho động vật nuôi cũng
chưa tương xứng với nhu cầu và tốc độ tăng trưởng của nghề chăn nuôi dê, cừu.
Dịch bệnh gia súc là một trong những nguyên nhân hạn chế sự phát triển của chăn
nuôi. Vì vậy, trong thời gian tới ngành Nông nghiệp đã xác định nhiệm vụ trước hết
là khống chế cácbệnh truyền nhiễm nguy hiểm, sau đó từng bước khống chế các
bệnh truyền nhiễm mãn tính, các bệnh do ký sinh trùng, các bệnh nội khoa, . Một
số bệnh thường gặp ở dê, cừu như bệnh tụ huyết trùng, bệnh đậu, bệnh viêm lở
miệng, trong đó, bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn Clostridium perfringens
gây ra đã làm tổn thất lớn cho người chăn nuôi.
Vi khuẩn C.perfringensphân bố rộng rãi trong thiên nhiên, thường thấy ở
trong đất, chất hữu cơ. Vi khuẩn C.perfringensthường có mặt trong dạ cỏ và ruột
của dê, cừu khỏe mạnh, bình thường chúng không gây bệnh nhưng do một số yếu tố
tiền đề như: thay đổi khẩu phần ăn đột ngột, stress vận chuyển, sức đề kháng giảm
tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sôi, phát triển và sinh độc tố gây bệnh. Các độc tố
của vi khuẩn được giải phóng ra rất nhanh và được hấp thu vào máu, khi đó thì các
triệu chứng của bệnh sẽ xuất hiện như: tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc
biệt có mùi thối khắm, co giật toàn thân, nghiến răng, chảy nước giải và chết sau vài
giờ.
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C.perfringenssản sinh hơn 17 loại độc
tố khác nhau như: độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2,
2
Enterotoxin, Theta, vv . Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha,
beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C.perfringensthành 5 type độc tố
(toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E). Trong đó type A sản sinh độc tố Alpha;
type B sản sinh độc tố Alpha, Beta, Epsilon; type C sản sinh độc tố Alpha, Beta;
type D sản sinh độc tố Alpha, Epsilon; và type E sản sinh độc tố Alpha và Iota.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của C.perfringens
gây bệnh đường tiêu hóa ở gia súc như bệnh viêm ruột họai tử, viêm dạ múi khế ở
loài nhai lại, hội chứng tiêu chảy ở bò, dê, lợn .(Mainil và cộng sự, 2006). Ở Việt
Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn
C.perfringens(Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự, 1995; Nguyễn Bá Hiên và cộng sự,
1999; Nguyễn Văn Sửu và cộng sự, 2003; Lê Lập và cộng sự, 2007). Tuy nhiên,
hiện chưa có công trình nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn C.perfringens trong
bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu nuôi tại khu vực miền Trung một cách đầy đủ và
hệ thống.
Có nhiều phương pháp phát hiện độc tố của vi khuẩn C.perfringens như phản
ứng trung hòa độc tố trên chuột, phản ứng ELISA, PCR. Trước đây phản ứng trung
hòa độc tố trên chuột thường được sử dụng phổ biến, tuy nhiên phương pháp này
cồng kềnh, tốn tiền, mất nhiều thời gian. Hiện nay phương pháp PCR được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt để phát hiện các gen quy
định các yếu tố gây bệnh của các loài vi sinh vật. Ưu điểm của phản ứng là có độ
nhạy, độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và
cho kết quả trong một thời gian ngắn. Vì thế, chúng tôi đặc vấn đề nghiên cứu:
“Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng
phản ứng Multiplex PCR”.
Mục đích của đề tài: góp phần cung cấp thông tin về chủng C.perfringens
đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừutrong những năm gần đây,
giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả để giảm thiểu tối đa những thiệt
hại do vi khuẩn C.perfringensgây ra.
3
Nội dung của đề tài:
1) Giám định các đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn
Clostridium perfringens được phân lập từ dê, cừu mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy tại
3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận;
2) Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR;
3) Đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế.
Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để
cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.
4
CHƯƠNGI.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Dựa trên phản ứng trung hòa trên chuột, Wilsdon (1931) đã phân
C.perfringens thành 4 type độc tố: từ type A đến D. Wilsdon nhận thấy kháng
huyết thanh của type A chỉ trung hòa được type A, typeB trung hòa được tất cả các
type còn lại, type C trung hòa được tất cả ngoại trừ type D, type D trung hòa được
cả type A và B. Ông nhận thấy rằng các kháng thể có trong huyết thanh làm mất tác
dụng của tất cả các loại kháng nguyên. Các kháng nguyên sau này được mô tả:
alpha có ở tất cả các type, beta có ở type B và C, epsilon có ở type B và D.
Bosworth (1943) đã phát hiện thêm type E, type này chỉ trung hòa được chính nó và
type A. Ông cho rằng có một độc tố chưa được phát hiện, sau này mô tả là độc tố
iota [18].
Uzal và cộng sự (1997) đã sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi: alpha
(Titbal et al 1989), beta (Hunter, 1992), epsilon (Havard, 1992), iota (Perelle 1993).
Theo ông thì các gen độc tố có kích thước như sau: alpha: 247 bp; beta 1025 bp;
epsilon: 403 bp; iota: 298 bp. Kết quả này gen độc tố: alpha: 242 bp; beta: 980 bp;
epsilon: 404 bp [43].
Han Sang Yoo và cộng sự (1997) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để định
type độc tố của vi khuẩn C.perfringens trên các đối tượng trâu, bò, lợn và gia cầm ở
Hàn Quốc. Kết quả thu được đoạn khuếch đại gen có kích thước như sau: Độc tố
alpha: 402 bp; beta: 236 bp; epsilon: 541 bp; iota: 317 bp [27].
Petrillo và cộng sự (2000)đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xét nghiệm
các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nam 12tuổi sau khi ăn ruột lợn bị nhiễm
C.perfringens. Kết quả cho thấy kích thước của các gen mã hóa loại độc tố được
khuếch đại như sau:alpha: 324 bp, beta:196 bp và epsilon: 655 bp (epsilon
primers), iota: 446 bp (iota primers), cpb2: 567 bp (beta 2 primers) [42].
Augustynowicz và cộng sự (2002) đã thực hiện phản ứng PCR với việc dùng
cặp mồi PL3/PL7 cho đoạn pcl(gen mã hóa cho C.perfringensphospholipase C) và
5
cặp mồi PL145/PL146 cho cpe(mã hóa cho C.perfringensEnterotoxin). Kết quả
thu được 70% mẫu lấy từ các ca ngộ độc thực phẩm là type A, 66% mẫu có mang
gene cpe. Trong tổng số 63 mẫu đem phân tích có 21 mẫu (33%) pcl+, cpe-, CPE -;
26 mẫu (41%) pcl+, cpe+, CPE+; 16 mẫu (25%) pcl+, cpe+, CPE-. Chỉ có
C.perfringenstype A mới mang gene cpe [24].
Bueschel D. M. và cộng sự (2002) đã xác định tỷ lệ gene cpb2tìm thấy ở các
type vi khuẩn C. perfringensbằng việc cải tiến kỹ thuật Multiplex PCR (Meer và
Songer, 1996) bằng việc kết hợp thêm cặp mồi đặc hiệu cpb2(Garmory và cộng sự
năm 2000) vào trong phản ứng. Tác giả đã sử dụng 3270 chủng C.perfringensphân
lập được từ động vật mắc bệnh viêm ruột và động vật khỏe. Kết quả cho thấy: Phần
lớn các trường hợp động vật bị bệnh đều định được type vi khuẩn (85,5%), trong đó
chủ yếu là type A chiếm 92,4%. Tỷ lệ cpb2xác định được 37,2% trong tổng số
mẫu phân lập. Tỷ lệ cpb2tìm thấy có sự khác nhau giữa các loài. Ở lợn bị bệnh
viêm ruột tỷ lệ dương tính với cpb2là 85,8% (n = 1132), có s ự tương quan giữa lợn
sơ sinh mắc bệnh viêm ruột hoặc tiêu chảy với tỷ lệ cpb2(91,8% với n = 256) và
phần lớn là type A, do đó type A là nguyên nhân chính gây bệnh ở lợn sơ sinh. Tỷ
lệ cpb2tìm thấy ở bò là 12,8%(n = 1537), trong đó bò bị bệnh viêm ruột, nhiễm độc
máu, đột tử là 21,4% (n = 336), và ở bê bị viêm ruột và dạ múi khế là 47,3% (n = 93
). Tỷ lệ cpb2 ở dê là 11,7% (n = 34), cừu là 19,2% (n = 52) [19].
Sipos và cộng sự (2003) đã sử dụng kỹ thuật Mutiplex PCR định type độc tố
vi khuẩn C.perfringenstrên các loại động vật khác nhau. Kết quả: Ở cừu: 8/10
chủng thuộc type A và 2/10 chủng thuộc type D (chủ yếu tìm được ở cừu non dưới
3 tuần tuổi). Ở lợn: 47/52 chủng thuộc type A (chủ yếu ở lợn con theo mẹ), 5/52
chủng thuộc type C. Còn ở dê: 18/26 mẫu thuộc type D, 6/26 mẫu thuộc type A và
2/26 mẫu thuộc type E [38].
Wen và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và thấy rằng nguyên nhân gây ngộ độc
do vi khuẩn C.perfringenschủ yếu là do type A sản sinh độc tố Enterotoxin. Gene
mã hóa độc tố này nằm trên nhiễm sắc thể. Nha bào của những chủng này đều có
khả năng chịu được nhiệt độ cao [35].


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, Nxb. Giáo dục Tp. Hồ
Chí Minh, tr 190-199.
2. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên (2009), Một số đặc
tính sinh học của vi khuẩn clostridium perfringens phân lập từ bò và lợn mắc hội
chứng tiêu chảy tại Hà Nội và vùng phụ cận,Khoa học Kỹ thuật Thú y, Tập XVI,
Số 4/2009.
3. Lê Lập, Nguyễn Đức Tân và cộng sự (2007). Phân lập và xác định type
độc tố (Toxinotype) của vi khuẩn Clostridium perfringens ở động vật nhai lại bằng
kỹ thuật Multiplex PCR, Tạp chí NN & PTNN-kì 1, tháng 5/2007.
4. Nguyễn Bá Hiên, 1999. Kết quả xác định số lượng và sự biến động của
trực khuẩn yếm khí Clostridium perfringens trong phân gia súc khỏe và mắc hội
chứng tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu KHKT Khoa Chăn nuôi thú y. 1996-1998.
Nxb. Nông nghiệp Hà Nội, 1999, tr: 109-110.
5. Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP.
Hồ Chí Minh, tr. 39 –42.
6. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm (1997), Vệ sinh và an toàn thực
phẩm, Đại học kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Ngọc Nhiên, Trần Thị Hạnh, Vũ Đình Hưng, Ngô Thị Nhu, 1995.
Viêm ruột hoại tử ở hươu nai do Clostridium perfringens và kết quả phòng bệnh
bằng giải độc tố (toxoid).Các báo cáo khoa học thú y. Viện thú y Hà Nội. 1995.
8. Nguyễn Quang Tính, 2007. Xác định vai trò gây bệnh đường tiêu hóa của
vi khuẩn Clostridium perfringens ở trâu, bò, dê tại tỉnh Thái Nguyên và biện pháp
phòng trị. Luận án tíến sỹ Nông nghiệp, Viện thú y. Hà nội, 2007.
9. Nguyễn Thị Hiền (chủ biên) –Phan Thị Kim –Trương Thị Hòa –Lê Thị
Lan Chi (2003). Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương thực –thực phẩm, NXB Nông
nghiệp HN.
52
10. Nguyễn Văn Sửu, Nguyễn Quang Tuyên, 2003. Biến động số lượng vi
khuẩn trong phân bê nghé bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền núi phía Bắc. Tạp chí
KHKT Thú y, tập X, số 4, trang 38-42.
11. Phạm Hồng Sơn (2002). Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp HN.
12. Phạm Thành Hổ. (2004). Di truyền học. NXB Giáo dục.
13. Trần Linh Thước (2004). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mĩ phẩm,NXBGD Tp. HCM.
14. Trần Thị Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2000). Cơ sở di truyền và công
nghệ gen, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, tr.157 –171.
15. Trường Đại Học Y Hà Nội (2004). Dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực
phẩm, NXB Y Học, Hà Nội, 353 –370.
Tài liệu tiếng Anh
16. Anders Johansson (2006). Clostridium perfringens the causal agent of
necrotic enteritis in poultry.
17. Annamari Heikinheimo (2008). Diagnostic and molecular epidemiology of
cpe-positive Clostridium perfringens type A.
18. Bosworth T J (1943). On a new type of toxin produced by Clostridium
welchii. J Comp Pathol.;53:245–255.
19. Bueschel D. M, Jost B. H, Billington S. J,Trinh Hien T, Songer J G (
2003). Prevalence of cpb2, encoding beta 2 toxin, in C. perfringens field isolates:
correlation of genotype with phenotype, 121-129.
20. Carter, G.R. (1984). Pasteurella, Yersinia and Francisella in Diagnostic
procedures in Veterrinary Bacteriology and Microbiology. 4
th
and Thomas
Publisher Sprinfield. p111-121.
21. Cato, E.P.W.L.Geonge, and S.M.Finegold (1984). Clostridium, 1141 –
1200.
22. Charles L. Hatheway (1990), Toxigenic clostridia, Clin. Microb. Rev.
3:66-76.
53
23. Dawn, M., Bueschel, B.H., Jost, S.J., Billington, Hien T. Trinh, and
Songer, J.G (2003). Prevalence of cpb2, endcoding beta2 toxin in Clostridium
perfringens field isolates: correlation of genenotype with phenotype. Veterinary
microbiology
24. E. Augustynowicz, A. Gzyl và J. Slusarczyk (2002). Detection of
enterotoxingenic Clostridium perfringens with a duplex PCR.
25. Effat, M. M; Abdallah, Y. A. , Soheir, M. F. 1, DNA Rady, M. (2007).
Characterization of Clostridium perfringens feildisolates, implicated in necrotic
entritis outbreaks on private broiler farms in Cairo, by multiplex PCR. African
Charles L. Hatheway (1990), Toxingenic clostridia, Clin. Microb. Rev.
26. García-Alvarado J.S., M.A. Rodriguez, R.G. Labbé, 1992. Influence of
elevated temperature on starch hydrolysis by enterotoxin-positive and enterotoxin-negative strains of C. perfringens type A. Applied and Environmental Microbiology,
Jan. 1992,p. 326-330.
27. Han Sang Yoo,Sang Un Lee, Kyoung Yoon Park Yong Ho Park(1997).
Molecular Typing and Epidemiological Survey of Prevalence of Clostridium
perfringens Types by Multiplex PCR.
28. Jolivet –Reynaud, C., H. Moreau, DNA J. E. Alouf. (1988). Purification
of alpha toxin from Clostridium perfringens: phospholipase C. Methods Enzymol.
165: 91-94.
29. Journal of Microbiology Research pp. 029-032.
30. Kalender, H. B. Ertas, B. Cetinkaya, A. Muz, N. Arslan, A. Kilic (2005).
Typing of isolates of Clostridium perfringens from healthy and diseased sheep by
multiplex PCR.
31. Lawrence, G., DNA R. Cooke. (1980). Experimental pigbel: the
production DNA pathology of necrotizing enteritis due to Clostridium welchii type
C in the guinea pig.Br. J. Exp. Pathol. 61:261-271.
32. McDonel, J. L. (1980). Clostridium perfringens toxins (type A, B, C, D, E).
Pharmacol. Ther. 10: 617-655.
54
33. Miserez R., J. Frey, C. Buogo, S.Capaul, A.Tontis, A.Byrnens and
J.Nicolet, 1998. Detection of α-and ε-toxigenic C. perfringens type D in sheep and
goats using a DNA amplification technique (PCR).Letters in Applied Microbiology
1998, 26: 382-386.
34. Miyashiro S., Nassar A. F. C., Delfava C., Cabral A. D., Silva M. (2007).,
Clostridium perfringens type A and D associated with enterotoxima inan 18-month-old goat.
35. Qiyi Wen và Bruce A. McClalane (2004). Detection of Enterotoxingenic
Clostridium perfringens Type A Isolates in American Retail Foods.
36. Quinn P.J., M.E. Carter, B. Markey, G.R. Carter, 1994. Clostridium
species. Clinal Verternary Microbiology.Wolfe Publishing, 191-208.
37. Shimizu, T., Ohtani, K., Hirakawa, H., Ohshima, K., Yamashita, A.,
Shiba, T., Ogasawara, N., Hattori, M., Kuhara, S. & Hayashi, H. (2002). Complete
genome sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh-eater.Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 996-1001
38. SIPOS W. ; FISCHER L. ; SCHINDLER M. ; SCHMOLL F. (2003).
Genotyping of Clostridium perfringens isolated from domestic and exotic ruminants
and swine.
39. Smith,L. DS., DNA B. L. Williams. (1984). The pathogenic anaerobic
bacteria, 3
rd
ed. Charles C Thomas, Publisher, Springfield, Ill.
40. Songer J.G. and Dawn Bueschel, 1999. Multiplex PCR Procedure for
Genotypeing Clostridium perfringens. Dep. Of Veterinary Science, University of
Arizona, Tucson. Dec16,1999.
41. Titball, R. W., S. E. C. Hunter, K. L. Martin, B. C. Morris, A. D. Shuttle-worth, T. Rubidge, D. W. DNAerson, DNA D. C. Kelly. (1989). Molecular cloning
DNA nucleotide sequence of the alpha –toxin (phospholipase C) of Clostridium
perfringens. Infect. Immun. 57:367-376.
42. Toni M. Petrillo, M.D., Consuelo M. Beck-Sagué, M.D., J. Glenn Songer,
Ph.D., Carlos Abramowsky, M.D., James D. Fortenberry, M.D., Lillian Meacham,
M.D., Andrew G. Dean, M.D., M.P.H., Hanmin Lee,M.D., Dawn M. Bueschel,