Luận Văn Xác định gen gây độc Pr1 và tính đa dạng di truyền đoạn gen Pr1của nấm Metarrhizium anisopliae trên

Trong các loài vi sinh vật gây hại côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ nấm
bất toàn mà quan trọng là nấm Metarrhizium anisopliae - một trong các loài có tính
diệt côn trùng mạnh nhất.
Nói chung, trên thế giới nấm Metarrhizium anisopliae và một số loại nấm khác
như Baeuveria bassiana, Normurea đã được nghiên cứu, sử dụng và thương mại hóa
từ lâu – như là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại
sâu hại thuộc bộ cánh phấn (Lepidoptera), và cánh cứng (Coleoptera) trên nhiều loại
cây trồng khác nhau.
Ở nước ta, những nghiên cứu về đặc tính sinh học, khả năng gây độc, xác định
sự đa dạng sinh học của nấm Metarrhizium anisopliae vẫn chưa rộng và chỉ thực hiện
ở mức độ hình thái. Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên nhiều loại côn trùng
của nhiều loại cây trồng khác nhau như trên sâu róm, sâu tơ, sâu khoang (ở miền Bắc);
trên rầy nâu, bọ xít đen, sâu cuốn lá lúa, sâu cắn gié, sâu xanh da láng, sâu tơ, bọ dừa,
rệp xáp, cào cào (ở miền Nam) (Phạm Thị Thuỳ và ctv, 2000).
Trong chiều hướng tiến đến xây dựng một nền nông nghiệp hàng hoá với sản
phẩm sạch và chất lượng cao, không ca ngợi và lạm dụng thuốc trừ sâu hoá học thì
việc nghiên cứu sâu hơn về các loại nấm này cần được quan tâm. Từ khi Metarrhizium
anisopliae có mặt ở khắp nơi, đòi hỏi phải có các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để
xác định gen gây độc của chúng nhằm chọn lọc ra những chủng nấm Metarrhizium
anisopliae có tính độc cao đảm bảo hoạt tính trừ sâu lâu dài và hiệu quả. Sự mô tả
đúng và chính xác những loài nấm Metarrhizium anisopliae sẽ đánh giá được tầm
quan trọng lớn nhất cho việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng như là tác nhân phòng
trừ sinh học ở những loài côn trùng khác nhau.
Một số kỹ thuật sinh học phân tử thật sự hữu hiệu trong việc nghiên cứu sâu
hơn về loại nấm này đã được sử dụng nhiều nơi trên thế giới như kỹ thuật PCR phát
hiện sự hiện diện của gen Pr1 (protease) của nấm Metarrhizium anisopliae; kỹ thuật
RFLP, RAPD dùng để xác định sự đa dạng di truyền của gen gây độc Pr1 giữa những
dòng nấm Metarrhizium anisopliae; đặc biệt là kỹ thuật sequencing có thể xác định
được cụ thể trình tự nucleotide của đoạn gen gây độc này.
Gen Pr1 là một chymoelastase, trở thành một yếu tố quyết định tác nhân gây
bệnh. Pr1 được sản xuất ra để ức chế carbon catabolite, nitrogen metabolite ở lớp biểu
bì côn trùng.
Trên cơ sở chưa có báo cáo khoa học nào trong nước nghiên cứu sâu hơn về
gen qui định tính độc và sự đa dạng di truyền bằng các phương pháp phân tử hiện đại.
Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài:”Xác định gen gây độc Pr1 và
tính đa dạng di truyền đoạn gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae trên côn
trùng gây hại.”

MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm tạ . iii
Tóm tắt iv
Mục lục . vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các bảng . x
Danh sách các hình . xi
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài . 2
1.2.1. Mục đích . 2
1.2.2. Mục tiêu 3
1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu 3
1.3. Đối tượng nghiên cứu . 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay . 4
2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng . 4
2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. . 5
2.2.2. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm. 9
2.3. Sơ lược về phương thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. . 10
2.4. Hoạt tính sinh học . 13
2.5. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về nấm Metarrhizium anisopliae
và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. . 17
2.5.1. Nghiên cứu trong nước . 17
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nước 17
2.6. Vai trò của protease Pr1 . 18
2.7. Phương pháp phát hiện gen Pr1 . 19
2.8. Phản ứng PCR 20
2.8.1. Giới thiệu chung về PCR . 20
2.8.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR . 21
2.8.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR 23
2.8.3.1. Sử dụng phương pháp PCR tổng hợp mẫu dò cho các thử nghiệm
S1 nuclease . 23
2.8.3.2. Sử dụng PCR để sàng lọc 23
2.8.3.3. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gen tổng hợp 24
2.8.3.4. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm 24
2.8.3.5. Định lượng bằng phương pháp PCR . 25
2.8.3.6. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR 26
2.8.4. Những hạn chế của phương pháp PCR 26
2.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide . 27
2.9.1. Nguyên tắc hoá học: phương pháp Maxam và Gilbert 28
2.9.2. Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid
của Sanger 28

3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 30
3.1. Thời gian và địa điểm . 30
3.1.1. Thời gian 30
3.1.2. Địa điểm . 30
3.2. Vật liệu và hoá chất 30
3.2.1. Vật liệu . 30
3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm . 30
3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự 31
3.2.2. Hoá chất và môi trường 31
3.2.2.1. Các hóa chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm 31
3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 31
3.2.2.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) . 32
3.2.2.4. Môi trường 32
3.2.3. Các thiết bị chính 32
3.3. Nội dung nghiên cứu 32
3.4. Phương pháp nghiên cứu 33
3.4.1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu
hại cây trồng . 33
3.4.1.1. Chuẩn bị môi trường PGA 33
3.4.1.2. Phương pháp tách bào tử . 33
3.4.2. Xác định qui trình PCR phát hiện gen Pr1 liên quan tới tính độc
của nấm Metarrhizium anisopliae . 33
3.4.2.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm . 33
3.4.2.2. Phương pháp ly trích DNA . 34
3.4.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA 34
3.4.2.4. Khuếch đại gen Pr1-PCR 35
3.4.2.5. Điện di trên gel agarose . 36
3.4.2.6. Đọc kết quả điện di 37
3.4.3. Sử dụng phương pháp giải trình tự để xác định và phát hiện sự sai khác
cụ thể trong đa dạng di truyền nấm Metarrhizium anisopliae . 37
3.4.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR 37
3.4.3.2. Lượng DNA thích hợp cho đọc trình tự 38
3.4.3.3. Thành phần của phản ứng đọc trình tự 39
3.4.3.4. Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự 39
3.4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 39
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 41
4.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số
sâu hại cây trồng 41
4.2. Sử dụng phương pháp PCR phát hiện gen liên quan đến tính độc của
nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1). 43
4.2.1. Quy trình ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae. 43
4.2.2. Tiến hành phản ứng PCR . 45
4.2.3. Xác định trình tự nucleotide trong đoạn gen gây độc Pr1 của nấm
Metarrhizium anisopliae. . 47
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 53
5.1. Kết luận 53
5.1.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae 53
5.1.2. Phương pháp ly trích DNA và kỹ thuật PCR . 53
5.1.3. Phương pháp đọc trình tự gen Pr1 . 53
5.2. Đề nghị . 53
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56
7. PHỤ LỤC 59