Thạc Sĩ Xác định chỉ thị phân tử cho các dòng hoa cúc đột biến do chiếu xạ và đánh giá tính ổn định di truyề

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Tp. HCM, tháng 09 năm 2012

MỤC LỤC ( Luận văn dài 83 trang có File WORD)

Trang phụ bìa i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục từ viết tắt . v
Danh mục bảng biểu vi
Danh mục hình . vii
Lời mở đầu 1

Chương 1: Tổng quan tài liệu .. .. . 4

1.1 Hoa cúc và việc chọn tạo giống đột biến . 4
1.2 Chỉ thị phân tử 5
1.3 RAPD . 6
1.4 Bức xạ tạo giống . 7
1.4.1 Sơ lược lịch sử chọn tạo giống cây trồng . 7
1.4.2 Một số thành tựu của thế giới 9
1.4.3 Tình hình thực tiễn ở Việt Nam . 10

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và các phương pháp nghiên cứu . 13
2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 13
2.1.1 Đối tượng, vật liệu xác định chỉ thị phân tử . 13
2.1.2 Đối tượng, vật liệu khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của
các dòng cúc đột biến qua các thế hệ in vitro . 17
2.2 Các phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1 Tạo vật liệu nghiên cứu . 19
2.2.2 Tách chiết DNA . 20
2.2.3 RAPD-PCR . 22
2.2.4 Điện di trên gel agarose . 23
2.2.5 Thống kê phân tích số liệu . 23
2.2.6 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 23


Chương 3: Kết quả và biện luận 25

3.1 Kết quả xác định chỉ thị phân tử 25

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA . 25
3.1.2 Kết quả phản ứng RAPD . 25
3.1.3 Kết quả phân tích đa dạng di truyền 3 giống cúc và các dòng đột
biến phát sinh từ chúng 27
3.1.4 Kết quả xác định chỉ thị RAPD cho các dòng cúc 29
3.2 Kết quả khảo sát tính ổn định di truyền của 3 giống cúc và các đột biến phát sinh từ chúng qua các thế hệ in vitro . 33
3.2.1 Kết quả tách chiết DNA . 33
3.2.2 Kết quả phản ứng RAPD . 34
3.2.3 Kết quả khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của các dòng cúc nghiên cứu qua các thế hệ in vitro

Chương 4: Kết luận và đề nghị .. .. . 41
4.1 Kết luận 41
4.2 Đề nghị . 42
Tài liệu tham khảo .. .. .. . 43

Phụ lục .. .. .. .. 46
Phụ lục 1: Tạo vật liệu nghiên cứu 46
Phụ lục 2: Sàng lọc đột biến 48
Phụ lục 3: Phân tích kết quả RAPD cho từng mồi trong thí nghiệm xác định chỉ
thị phân tử cho các dòng đột biến 50
Phụ lục 4: Ma trận thống kê các băng điện di trong thí nghiệm xác định chỉ thị
phân tử 64
Ảnh điện di 24 mẫu khảo sát tính ổn định di truyền qua các thế hệ in vitro với
14 mồi RAPD . 72



DANH MỤC BẢNG BIỂU

[TABLE]
[TR]
[TD]STT
[/TD]
[TD]Nội dung bảng biểu
[/TD]
[TD]Trang
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 1.1
[/TD]
[TD]
Số lượng giống cây trồng thu nhận được bằng phương
pháp bức xạ tạo giống qua các năm
[/TD]
[TD]
10
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]

Bảng 2.1
[/TD]
[TD]Giống, kí hiệu, kiểu chiếu, liều chiếu, nguồn gốc và đặc điểm chính của các dòng/giống hoa cúc sử dụng trong nghiên cứu
[/TD]
[TD]

13
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 2.2
[/TD]
[TD]
Tên và trình tự 33 mồi RAPD
[/TD]
[TD]
17
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 2.3
[/TD]
[TD]Kí hiệu, đặc điểm hoa và nguồn gốc của các mẫu nghiên cứu
[/TD]
[TD]
18
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 2.4
[/TD]
[TD]
Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD-PCR
[/TD]
[TD]
22
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]

Bảng 3.1
[/TD]
[TD]
Thống kê số băng DNA thu được của 9 mẫu hoa cúc với
33 mồi RAPD
[/TD]
[TD]

26
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 3.2
[/TD]
[TD]
Hệ số tương đồng di truyền giữa 9 mẫu giống hoa cúc
[/TD]
[TD]
27
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 3.3
[/TD]
[TD]
Marker nhận dạng các giống/dòng cúc theo nhóm
[/TD]
[TD]
31
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 3.4
[/TD]
[TD]
Thống kê số băng DNA thu được của 24 mẫu hoa cúc với 14 mồi RAPD
[/TD]
[TD]
34
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 3.5
[/TD]
[TD]
Hệ số tương đồng di truyền giữa các thế hệ của các
dòng hoa cúc đột biến và đối chứng
[/TD]
[TD]
38
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Bảng 4.1
[/TD]
[TD]
Marker nhận dạng cho một số dòng hoa cúc đột biến
được khảo sát
[/TD]
[TD]

41
[/TD]
[/TR]
[/TABLE]







DANH MỤC HÌNH



[TABLE]
[TR]
[TD]STT
[/TD]
[TD]Nội dung bảng biểu
[/TD]
[TD]Trang
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD]
Hình 1.2
[/TD]
[TD]
Hoa cúc (chrysanthemum morifolium Ramat.)
[/TD]
[TD]
4
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 1.2
[/TD]
[TD] Giống cúc Red Nero của Ba Lan (trái) và giống Mini Nero (phải) được tạo ra từ Red Nero bằng phương pháp bức xạ tạo giống
[/TD]
[TD]
5
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 1.3
[/TD]
[TD] Sơ đồ quy trình RAPD với hai vòng lặp nhiệt ban đầu
[/TD]
[TD] 7
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.1
[/TD]
[TD] Hoa cúc artfarm trắng đối chứng
[/TD]
[TD] 15
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.2
[/TD]
[TD]Dòng đột biến A4[/TD]
[TD] 15
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.3
[/TD]
[TD] Dòng đột biến A34
[/TD]
[TD] 15
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.4
[/TD]
[TD] Hoa cúc đóa trắng đối chứng
[/TD]
[TD] 15
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.5
[/TD]
[TD] Dòng đột biến B3
[/TD]
[TD] 16
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.6
[/TD]
[TD] Dòng đột biến B14
[/TD]
[TD] 16
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.7
[/TD]
[TD] Hoa cúc saphia vàng đối chứng
[/TD]
[TD] 16
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.8
[/TD]
[TD] Dòng đột biến F7
[/TD]
[TD]16
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 2.9
[/TD]
[TD] Dòng đột biến F29
[/TD]
[TD]16
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.1
[/TD]
[TD] Kết quả tách chiết DNA của 3 giống đối chứng và 6
dòng đột biến
[/TD]
[TD] 25
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.2
[/TD]
[TD]Cây sơ đồ đa dạng di truyền của 9 dòng/giống cúc nghiên cứu[/TD]
[TD] 28
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.3
[/TD]
[TD] Chỉ thị cho dòng A34: Mồi OPC10 – băng 350bp
[/TD]
[TD] 29
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.4
[/TD]
[TD] Chỉ thị cho dòng A4: Mồi OPN10 – băng 650bp
[/TD]
[TD] 29
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.5
[/TD]
[TD] Chỉ thị cho dòng B3 và F7: Mồi OPC2 – lần lượt các
băng 550 và 650bp
[/TD]
[TD]

30
[/TD]
[/TR]
[/TABLE]




[TABLE]
[TR]
[TD]
Hình 3.6
[/TD]
[TD]
Chỉ thị cho dòng B14: Mồi S258 – băng 1200bp
[/TD]
[TD]
30
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.7
[/TD]
[TD] Chỉ thị cho dòng F29: Mồi OPN7 – băng 250 và 650bp
[/TD]
[TD] 31
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.8
[/TD]
[TD] Kết quả điện di RAPD mồi OPN5
[/TD]
[TD] 35
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.9
[/TD]
[TD] Kết quả điện di RAPD mồi OPN15
[/TD]
[TD] 35
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.10
[/TD]
[TD] Kết quả điện di RAPD mồi S208
[/TD]
[TD] 36
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.11
[/TD]
[TD] Kết quả điện di RAPD mồi S256
[/TD]
[TD] 36
[/TD]
[/TR]
[TR]
[TD] Hình 3.12
[/TD]
[TD] Sơ đồ đa dạng di truyền của các dòng cúc đột biến qua các thế hệ in vitro
[/TD]
[TD]
39
[/TD]
[/TR]
[/TABLE]



Lời mở đầu

Ở Việt Nam những năm gần đây, cơ cấu cây trồng nông nghiệp chuyển đổi nhanh chóng trong nền kinh tế thị trường, trong đó có sự phát triển mạnh mẽ của ngành trồng hoa cắt cành. Việc kinh doanh hoa đã và đang được xã hội rất quan tâm vì hoa không chỉ đem lại giá trị trong đời sống tinh thần, mà trên thực tế đã đem lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất, giúp cải thiện và nâng cao đời sống của nông dân.
Trong các loài hoa, cây hoa cúc được phát triển nhanh vì nó là loài hoa đẹp, đa dạng, được dùng để trang trí, dùng cho các hoạt động lễ hội và làm dược liệu. Cúc được trồng nhiều nơi trên thế giới bởi tính thích nghi cao, dễ sản xuất, vận chuyển và tiêu thụ. Thực tế việc trồng cây hoa cúc ở Việt Nam nói chung và Đà lạt nói riêng, đã tạo công ăn việc làm cho hàng vạn lao động nông nghiệp, góp phần tích cực trong việc phát triển đời sống kinh tế của người dân. Tuy nhiên, việc phát triển sản xuất hoa cúc ở nước ta còn gặp nhiều hạn chế vì hầu hết các giống hoa cúc có giá trị thương mại trên thị trường hiện nay đều là những giống nhập nội, trong khi đó giống cúc bản địa lại ít có giá trị kinh tế cũng như xuất khẩu. Đó là một trong số nhiều lý do khiến cho việc chọn và tạo giống cúc mới, có tính cạnh tranh thương mại cao trở thành một nhiệm vụ cấp bách cho các nhà khoa học Việt Nam.
Để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng cạnh tranh hơn, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng nhiều phương pháp như: chuyển gen, gây đột biến thực vật b ng các tác nhân vật lý và hóa học. Trong số đó, phương pháp chiếu xạ gây đột biến đã được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo nâng cao chất lượng các giống cây trồng nói chung và hoa cúc nói riêng, nh m phát triển các giống cây với các đặc điểm sinh học được cải tiến. Muller và Xapeghin là những người đầu tiên đưa ra khả năng sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng, và từ đó sàng lọc ra giống mới từ các cây đột biến. Sau đó phương pháp chọn giống mới này đã thu hút được sự chú ý của nhiều người đặc biệt là các nhà di truyền chọn giống trên khắp thế giới Có rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn giống lựa chọn. Các tác nhân phóng xạ được sử dụng là tia X, tia gamma, ion beam có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế bào dẫn đến sản sinh các đột biến vô hướng có thể có lợi hoặc có hại, thậm chí gây chết tế bào và cơ thể sinh vật. Những đột biến có thể được chọn lọc qua nhiều thế hệ để tạo ra các giống mới có tính trạng khác biệt so với giống ban đầu. B ng phương pháp chiếu xạ kết hợp với kỹ thuật nhân giống in vitro, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều giống cây trồng mới có chất lượng tốt hơn so với cây giống nguyên liệu ban đầu và thời gian được rút ngắn đáng kể.
Việc nhận dạng và xác định chính xác các giống cây trồng rất quan trọng đối với các nhà chọn giống thực vật cũng như các nhà vườn. Trước đây, các giống cây mới được xác định dựa trên các đặc tính nông sinh học và cảm quan của các nhà chọn giống nên rất khó đánh giá chính xác nguồn gốc và đặc điểm của cây. Gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử không ngừng được phát triển và đã giúp cho việc đánh giá đa dạng di truyền của các giống cây trồng được dễ dàng, thuận lợi và chính xác hơn.

Mục tiêu của đề tài

- Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định chỉ thị phân tử cho các dòng hoa cúc mới thu nhận được nhờ kỹ thuật bức xạ gây tạo giống.
- Khảo sát và đánh giá tính ổn định di truyền của các giống mới được tạo ra nhờ kỹ thuật chiếu xạ gây đột biến qua các thế hệ in vitro.

Mục đích và ý nghĩa của đề tài

Về lý luận khoa học, việc xác định chỉ thị phân tử đặc trưng cho từng dòng cúc đột biến phát sinh từ các giống cúc nguyên liệu giúp khẳng định sự khác biệt về mặt di truyền của chúng so với giống nguyên liệu và các giống khác. Sự ổn định di truyền của chúng qua các thế hệ giúp khẳng định chúng sẽ tồn tại lâu dài như một giống mới hoàn toàn, khác biệt lâu dài về cả hình thái lẫn bộ máy di truyền so với giống gốc. Từ đó khẳng định r ng, phương pháp chiếu xạ gây đột biến là một trong những phương pháp có hiệu quả rõ ràng trong việc chọn tạo giống mới cho cây trồng nói chung và hoa cúc nói riêng. Kết quả này cũng là cơ sở cho các nhà khoa học đăng ký giống mới.
Về thực tiễn, phương pháp chiếu xạ đột biến sẽ giúp các nhà khoa học, các nhà sản xuất của Việt Nam có một công cụ hữu hiệu trong việc tạo ra nguồn nguyên liệu để chọn ra các giống mới đáp. Một khi đảm bảo được tính cạnh tranh với các giống ngoại nhập, các nhà sản xuất sẽ giảm thiểu việc nhập nội giống từ nước ngoài, và thậm chí có thể tiếp cận với thị trường xuất khẩu.

Tóm tắt kết quả đã đạt được

- Đã xác định được chỉ thị phân tử RAPD cho các dòng hoa cúc đột biến tiềm năng và các giống đối chứng của chúng.
- Đã khảo sát sự ổn định di truyền của các dòng cúc đột biến và đối chứng của chúng qua 7 thế hệ in vitro. Kết quả cho thấy bộ máy di truyền của chúng ổn định.
- Ngoài việc xác định tính ổn định di truyền b ng kỹ thuật phân tử, các dòng hoa cúc đột biến tiềm năng cũng đã được theo dõi sự ổn định của kiểu hình qua 3 thế hệ trồng ngoài đồng. Kết quả, kiểu hình của những dòng đột biến tiềm năng biểu hiện ổn định.