Luận Văn Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG . iv
DANH MỤC HÌNH . v
DANH MỤC CÁC CHỮVIẾT TẮT vii
LỜI NÓI ĐẦU . 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU . 2
1.1.1. Trên thếgiới . 2
1.1.2. Tại Việt Nam 4
1.2. VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV) 9
1.2.1. Hình thái, Cấu trúc . 9
1.2.2. Cơ chếxâm nhiễm 11
1.2.3. Cách thức lan truyền . 11
1.2.4. Dấu hiệu tôm nhiễm bệnh . 11
1.2.5. Sựnhạy cảm của các loài tôm với LSNV 12
1.2.6. Mô mục tiêu . 13
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LSNV TRÊN TÔM 13
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học . 13
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ 14
1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tửtruyền qua 15
1.3.4. Phương pháp PCR 15
1.3.4.1. Chương trình PCR 16
1.3.4.2. Các thành phần và ảnh hư ởng của chúng t ới hi ệu quả của ph ản ứng PCR. 17
1.3.5. Phương pháp RT-PCR 20
1.4. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀTÀI . 21
1.4.1. Tính cấp thiết . 21
1.4.2. Mục tiêu của đềtài . 21
ii
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
2.1. VẬT LIỆU . 22
2.1.1. Mẫu thí nghiệm 22
2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR . 22
2.1.3. Hóa chất . 23
2.2.4. Thiết bịchuyên dụng 24
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 24
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25
2.3.1. Thu và chuẩn bịmẫu 25
2.3.2. Tách chiết RNA tổng số . 25
2.3.2.1. Nguyên tắc . 25
2.3.2.2. Phương pháp tiến hành 25
2.3.3. Nhân gen bằng kỹthuật RT-PCR . 26
2.3.3.1. Thiết lập điều kiện phản ứng 26
2.3.3.2. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độlai . 28
2.3.3.3. Tính đặc hiệu của phương pháp . 28
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện của phươngpháp (độnhạy của quy trình) 29
2.2.4. Điện di trên gel agarose . 29
2.2.4.1. Nguyên tắc . 29
2.2.4.2. Phương pháp tiến hành . 29
CHƯƠNG III. KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN . 31
3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 31
3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết . 31
3.1.1.1. Các thông sốcủa mồi . 31
3.2.1.2. Tính đặc hiệu củamồi 34
3.2.2. Khảo sát sựhoạt động của mồi trên thực tếvà các điều kiện của phản ứng
PCR . 35
3.2.2.1. Khảo sát sựhoạt động của mồi trên thực tế 35
3.2.2. Xác định nhiệt độbắt cặp tối ưu . 36
iii
3.2.3. Xác định tính đặc hiệu 38
3.2.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp 39
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰCTỈNH
KHÁNH HÒA . 42
3.3.1. Tỷlệtôm sú nhiễm LSNV theo mùa thu mẫu . 44
3.3.2. Tỷlệtôm sú nhiễm LSNV theo khu vực thu mẫu . 45
3.3.3. Tỷlệtôm sú nhiễm LSNV theo loại mẫu 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 51
PHỤLỤC . 52
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Ước tính sản lượng tôm nuôi tại châuÁ và châu Mỹlatin . 3
Bảng 2.1. Các mẫu thu ởcác khu vực tỉnh Khánh Hòa 22
Bảng 2.2: Các thông sốcủa cặp mồi LSNV 20AF/20AR 22
Bảng 3.1: Một sốđặc tính của cặp mồi LSNV 20AF/20AR 31
Bảng 3.2: Kết quảkhảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tínhtheo mùa
(mẫu thu từtháng 11/2011 đến tháng 5/2012) 44
Bảng 3.3: Kết quảkhảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tính theo
khu vực thu mẫu 46
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sản lượng tôm nuôi trên thếgiới năm 2001 5
Hình 1.2: Năng suất và sản lượng tôm nuôi Việt Nam từ năm 2001 đến năm 2011.
6
Hình 1.3:Kết quảso sánh trình tựnucleotide một phần gen RNA polymerase phụ
thuộc RNA (RdRp) từchủng LSNV phân lập ởSóc Trăng (LSNV-VN) và các
chủng ởThái Lan 8
Hình 1.4: Kết quảphân tích sựtương đồng của chuỗi trình tựacid amin của LSNV
và một sốvirus có RdRp từhọLuteovirida và từNấm 9
Hình 1.5: Cây phân loại chuỗi 13 acid amin virus RNA polymerase phụthuộc
RNA (Clustal W) tần sốkhởi động 1000 . 10
Hình 1.6: Hình tôm sú thảnuôi sau 100 ngày có biểu hiện chậm lớn (concó kích
thước nhỏ) so với tôm bình thường (con có kích thước bình thường) trong cùng một
ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng . 12
Hình 1.7: Thểvùi mô tôm bịnhiễm bệnh và mô tôm bình thường nhuộm bằngkỹ
thuật nhuộm thường quy (H & E) . 14
Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ(insitu) dương tính với mẫu dò
20A của mẫu tôm ởđộphóng đại thấp (a) và ởđộphóng đại cao (b) . 14
Hình 1.9: Ảnh chụp hiển vi điện tửmẫu tôm nhiễm bệnh cho thấy các hạt virus 15
Hình 1.10: Chu kì của phản ứng PCR 17
Hình 1.11: Sơ đồminh họa một quy trình RT-PCR . 20
Hình 2.1: Sơ đồcách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đềtài . 24
Hình 3.2:Cấu trúc kẹp tóc của mồi 20AF và 20AR 32
Hình 3.3: Một sốcấu trúc self-dimer của mồi 33
Hình 3.4: Một sốcấu trúc hetero-dimer của mồi 20AF/AR . 33
Hình 3.5: Kết quảblast trình tựmồi xuôi và mồi ngược trên Genbank 34
Hình 3.6: Kết quảsắp gióng các mồi với trình tựchuẩn DQ127905.1 . 35
Hình 3.7: Kết quảáp dụng quy trình RT-PCR trên mẫu dương tính 36
Hình 3.8 :Kết quảđiện di sản phẩm PCR sau khi tối ưu hóa nhệt độlai 37
vi
Hình 3.8: Kết quảđiện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độđặc
hiệu của quy trình RT-PCR . 39
Hình 3.9: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR hai bước 40
Hình 3.10: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR một bước . 41
Hình 3.11:Kết quảRT-PCR các mẫu tôm sú dương tính với LSNV thu vào mùa mưa
42
Hình 3.12:Kết quảRT-PCR các mẫu tôm sú dương tính với LSNV thu vào mùa khô. 43
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
20AF : Mồi xuôi (forward primer)
20AR : Mồi ngược (reverse primer)
µl : Microlitre
µM : MicroMol
A : Adenosine
BChV : Bệnh khảm lá củcải đường(Beet cholorosis virus)
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
bp : Base pair
Btv : Bệnh lưỡi xanh (Bluetongue virus)
BYDV : Bệnh vàng lùn lúa mạch(Barlay yellow drawf virus)
C : Cytidine
CABYV : Virus truyền bệnh qua rệp vàng trên cây bí (Cucurbit aphid-borne
yellows luteovirus)
cDNA : Complementary DNA
dATP : Deoxyadenosine triphosphate
dCTP : Deoxycytidine triphosphate
dGTP : Deoxyguanosine triphosphate
DEPC : Nước cất xửlý Diethylpyrocarbonate
DIG : Digoxigenin
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
dTTP : Deoxythymidine triphosphate
dUTP : Deoxyuridine Triphosphate
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
FAO : Food and Agriculture Organization
G : Guanosine
GAV : Virus gây bệnh trên mang (Gill associated virus)
ha : Hecta
viii
HPV : Bệnh gan tụy (Hepatopacreatic parvovirus)
H&E : Kỹthuật nhuộm thường quy (Hematoxylin and Eosin)
Ibdv : Virus gây bệnh Gumboro ởgà (Infectious bursal disease
virus)
IHHNV : Virus gây bệnhhoại tửcơ quan tạo máu và dưới vỏ
(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus)
ISH : Lai tại chỗ (in situ hybridization)
JEV : Japanese encephalitis virus (Bệnhviêm não Nhật Bản)
kDa : Trạng Quỳnhdalton
MBV : Bệnhtôm còi (Monodon baculovirus)
mM : MilliMol
MSGS : Hội chứng chậm lớn (Monodon slow growth syndrome)
mRNA :RNA thông tin (Messenger RNA)
NCBI : National Center for Biotechnology Information
OD : Mật độquang (Optical Density)
PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction)
PLRV : Bệnhcuốn lá khoai tây (Potato leaf roll virus)
RdRp : RNA polymerase phụthuộc RNA
(RNA-dependent RNA polymerase)
RNA : Ribonucleic Acid
RT-PCR : Phản ứng khuếch đại gen sửdụng enzyme phiên mã ngược
(Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction)
RIA2 : Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2
(Research Institute for Aquaculture No.2)
RNAsin : RNase inhibitor
Rrv :Ross river virus
Sfv :Semliki forest virus
T : Thymidine
TAE : Tris -Acetic acid -EDTA
ix
TE : Tris –EDTA
TEM : Kính hiển vi điện tửtruyền qua
(Transmission electron microscopy)
Ta : Nhiệtđộlai (Annealing temperature)
Tm : Nhiệt độnóng chảy (Melting Temperature)
UNG : Uracil-DNA glycosylase
YHV : Bệnh đầu vàng (Yellow Head virus)
WSSV : Bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus)
Wnv : West nile virus
1
LỜI NÓI ĐẦU
Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang
lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới.Trong đó tôm sú (P. monodon) là
loài quan trọng được nuôi tại Việt Nam từhơn 30 năm qua. Trong nhiều năm loài
này được xem là giốngchính đưa Việt Nam vào danh sách những nước cung cấp
tôm quan trọng của thếgiới. Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ,
dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công
nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Dịch bệnh do virus là một
trong những nguyên nhân gây nguy hiểm cho môi trường biển. Người ta ước tính
rằng khoảng 60%thiệt hại kinh tế ởtôm nuôi trồng thủy sản đã được gây ra bởi các
mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn. Có nhiều loài virus được tìm
thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên tôm sú (P. monodon)như GAV, YHV, MBV,
HPV . Laem singh virus (LSNV) là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại
nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp. Tôm sú nhiễm bệnh này thường
không thểhiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sựchậm lớn nên thường kéo dài vụnuôi
và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trịtôm sú nuôi. LSNV có mặt ở
tất cảcác giai đoạn sản xuất từtôm sú bốmẹ, tôm giống và tôm nuôi thương phẩm
với tỷlệcao ởViệt Nam. Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng
ngừa vàchẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền
thống như môbệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép
phát hiện sớm vàchính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp như lai in
situ, kính hiển vi điện tửTEM, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục
những nhược điểm vừa kểtrong việc phát hiện LSNV trên tôm sú giúp người
nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây
ra, nâng cao năng suất.
Vì những lý do trên,chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng quy trình PCR
đểphát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ởtỉnh Khánh Hòa”.
Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:
- Ứng dụng quy trình PCR chu ẩn phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ng ờnhiễm bệnh.
- Khảo sát sựhiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú khu vực tỉnh
Khánh Hòa.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU
1.1.1. Trên thế giới
Nuôi trồng thủy sản là một trong những lĩnh vực sản xuất có các đóng góp đáng
kểvào nền kinh tếcủa nhiều quốc gia và cung cấp một lượng lớn nhu cầu thực
phẩm thủy sản cho con người, đồng thờiđóng góp tích cực vào việc làm giảm lượng
carbon trong khí quyển, góp phần làmgiảm biến đổi khí hậu . Trong các đối tượng
thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất. Theo công bố
của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO – Food and Agriculture
Organization), sản lượng tôm nuôi ngày càng tăng, mức tăng bình quân khoảng
10,5% mỗi năm, cụthểnăm 2003 ước đạt 1,35 triệu tấn tăng 11% so với sản lượng
ước tính năm 2002 và 15% so với sản lượng thực tếnăm 2001. Hơn thếnữa, theo
dựbáo của trung tâm thủy sản thếgiới, nhu cầu tiêu thụtôm ngày càng tăng ởcả
các nước phát triển và các nước đang phát triển. Với hiệu quảkinh tếvà xã hội to
lớntrên, nghềnuôi tôm thực sự trởthành nghềsản xuất thu hút các nhà đầu tư. Theo
ước tính sản lượng tôm nuôi thếgiới 2007 –2012 của Liên minh người nuôi trồng
thủy sản toàn cầu (Global Aquaculture Alliance) tại Hội thảo 2010 đã công bố
thông tin vềsản lượng tôm thếgiới(Bảng 1.1). Ước tính sản lượng tôm nuôi ngày
càng tăng.
Bên cạnh những lợi nhuận mang lại thì thiệt hại do nghềnuôi tôm gây ra cũng
rất lớn. Dịch bệnh liên tiếp xảy ra ởnhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là ởcác nước
châu Á. Trong đó bệnh virus bùng phát gây ảnh hưởng đặc biệt nghiêm trọng đến
ngành công nghiệp nuôi tôm trên toàn thếgiới. Ước tính tổng thiệt hại do virus gây
ra là hàngtỷUSD mỗi năm.
Năm 2002, nông dân nuôi tôm ởThái Lan gặp hàng loạt vấn đềvới hiện tượng
chậm lớn ởtôm sú nuôi MSGS (Monodon slow growth syndrome)(Kanokpornvà
cộng sự, 2004). Báo cáo sau đó ởhội nghịlần thứ5 của tổchức Asia Regional
Advisory Group vềlĩnh vực sức khỏe vật nuôi thủy sản (2006) cho thấy hội chứng
3
chậm lớn đặc biệt tác động nghiêm trọng lên các hộnuôi tôm sú ởThái, và đã làm
thiệt hại lớn vềsản lượng (ước lượng khoảng 1,6 tỷUSD) vào năm 2002. Hội
chứng chậm lớn trên tôm sú nuôi (MonodonSlow Growth Syndrome, MSGS) xuất
hiện và nhanh chóng lan sang các nước trong một khoảng thời gian ngắn, cho thấy
có khảnăng nguyên nhân xuất phát từmột tác nhân gây bệnh truyền nhiễm. Một số
thông tin cho rằng hiện tượng tôm sú chậm lớn cũng đang xảy ra ở Ấn Độ,
Indonesia, Malaysia và Việt Nam(Flegelvà cộng sự, 2006).
Bảng 1.1: Ước tính sản lượng tôm nuôi tại châu Á và châu Mỹ latin
( Nguồn:http://agro.go v.vn/news/tID18617_Uoc - tinh - san -luong - tom -nuoi - the -gioi - 2007-- 2012.htm )
Một điều tra liên quan đến sựhiện diện của các tác nhân gây bệnh ởao có
MSGS lẫn ao bình thường. Theo đó các mẫu tôm có biểu hiện chậm lớn được kiểm
tra sựhiện diện của một sốtác nhân virus gây bệnh:tôm còi (Monodon baculovirus
- MBV), bệnh gan tụy (Hepatopacreatic parvovirus - HPV) và bệnh hoại tửcơ quan
tạo máu và dưới vỏ(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus -IHHNV) bằng phương pháp PCR.Kết quảcho thấy trong nhiều trường hợp, các ao
bịnhiễm hai hoặc nhiều hơn một virus cùng lúc. Tuy nhiên, không có mối tương
quan giữa các tác nhân gây bệnh này với sựhiện diện MSGS. Các kết quảnghiên
cứu chỉra rằng có thểcó một tác nhân gây bệnh mới gây ra hiện tượng MSGS.
4
Trong quá trình điều tra tác nhân gây bệnh MSGS tác giảSritunyalucksana và
cộng sựđã phát hiện ra sựhiện diện của một virus mới từmẫu bệnh phẩm có đặc
điểm của bệnh MSGS và đặt tên Laem singh virus (LSNV)(Sritunyalucksanavà
cộng sự, 2006).
Bệnh tôm chậm lớn do Laem Singh Virus là một trong những virus mới được
phát hiện gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm. Theo nghiên cứu của Pratoomthaivà
cộng sự(2007) các cá thểtôm có kích thước nhỏhay bình thường ởao bịnhiễm
MSGS đều có sựhiện diện của thểvirus hình lập phương LSNV. Bằng các phương
pháp khác nhau Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction (RT-PCR), kính
hiển vi điện tử(TEM), lai tại chỗvới mẫu dò đặc hiệu (ISH) và phương pháp mô
học các tác giảđã xác định LSNV có mặt ởcơ quan tạo máu lymphoid, mang, mô
thần kinh, ngoài ra các tác giảcòn phát hiện LSNV hiện diện trong mắt tôm .
Nhóm nghiên cứu của tác giảPrakasha đã tiến hành thu ngẫu nhiên 56 mẫu tôm
bệnh ởkhu vực ven bờTây Nam và Đông Nam Ấn Độđểxác định một sốtác nhân
gây bệnh WSSV, MBV, HPV bằng phương pháp PCR và LSNV bằng phương pháp
RT-PCR. Kết quảcho thấy 3 trong số56 mẫu dương tính với virus LSNV và đồng
thời cũng bịnhiễm WSSV, MBV hoặc HPV(Prakasha và cộng sự, 2007). Một
nghiên cứu vừa được công bố gần đây củatác giả Sittidilokratna đã ghi nhận một số
mẫu tôm súphát triển bình thường cũng nhiễm LSNV, cụthểlà Việt Nam có 2
trong số6 mẫu tôm súbình thường được xác định bịnhiễm LSNV, Malaysia có 6/6
mẫu tôm súbình thường nhiễm LSNV và 39 trong số40 mẫu tôm súcó nguồn gốc
từThái Lan có biểu hiện chậm lớn được xác định nhiễm LSNV. Cũng trong nghiên
cứu này các tác giảđã điều tra 81 mẫu tôm súthu năm 2007 ởAndhra Prades Ấn
Độ, kết quảcho thấy có đến 58,1% sốmẫu bịnhiễm LSNV(Sittidilokratnavà cộng
sự, 2009).
1.1.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, nghềnuôi tôm cũng đã phát triển khá lâu nhưng thực sựphát
triển mạnh trong những năm gần đây. Diện tích ao tôm ngày càng được mởrộng,
đồng thời sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh, đặc biệt từsau năm 2000 Việt Nam


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. HồHuỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB giáo dục, 2003.
2. Khuất Hữu Thanh, Cơ sởdi truyền phân tửvà kỹthuật gen.NXB Khoa Học và
KỹThuật, 2003.
3. Nguyễn ThịXô và Nguyễn ThịLoan ,Cơ sởDi Truyền và Công NghệGen.
NXB Khoa Học và KỹThuật, 2005.
4. Nguyễn Viết Dũngvà cộng sự, Phát hiện virus Laem singh bằng kỹthuật RT-PCR trên tôm sú nuôi (Penaeus monodon) ởđồng bằng sông Cửu Long.Nông
Ngiệp và Phát Triển Nông Thôn,, 2011. ISSN 0866-7020, (tháng 12/2011).
Trang 86-90.
5. Phạm Văn Ty, Virus học.
6. Võ ThịThương Lan, Giáo Trình Công NghệSinh học phân tửTếbào và ứng
dụng.NXB giáo dục, 2006.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Chomczynski, P. and N. Sacchi, Single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical
Biochemistry, 1987. 162(1): p. 156-159.
2. Flegel, T.W., Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, a historical
perspective with emphasis on Thailand.Aquaculture, 2006. 258(1–4): p. 1-33
3. Kanokporn, et al., Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger
shrimp Penaeus monodon cultivated in Thailand.Diseases of Aquatic
Organisms, 2004. 60(2): p. 89-96.
4. Lightner, D.V., Handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for
diseases of cultured penaeid shrimp.World Aquaculture Society, 1996. Baton
Rouge, LA.
5. Panphut, W., et al., A novel integrase-containing element may interact with
Laem-Singh virus (LSNV) to cause slow growth in giant tiger shrimp.BMC
Veterinary Research, 2011. 7(1): p. 18
6. Prakasha B. K., et al., Detection of Laem-Singh virus (LSNV) in cultured
Penaeus monodon from India.Diseases of Aquatic Organisms, 2007. 77(1): p.
83-86
7. Pratoomthai B., W.K., Flegel W.T., and Withyachumnarnkul B., Infection by
Laem-Singh Virus in the fasciculated zone and organ of Bellonci of the eyes of
small Penaeus monodon from Monodon slow-growth syndrome pond.Asian-Pacific Aquaculture., 2007. 199.
8. Pratoomthai, B., et al., Retinopathy in stunted black tiger shrimp Penaeus
monodon and possible association with Laem-Singh virus (LSNV).
Aquaculture, 2008. 284(1–4): p. 53-58.
9. Sathish Kumar T, et al., Natural host-range and experimental transmission of
Laem-Singh virus (LSNV).Diseases of Aquatic Organisms, 2011. 96(1): p. 21-27.
10. Sittidilokratna N, et al., Detection of Laem-Singh virus in cultured Penaeus
monodon shrimp from several sites in the Indo-Pacific region.Diseases of
Aquatic Organisms, 2009. 84(3): p. 195-200.