Luận Văn ứng dụng phương pháp pcr phát hiện Edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

Đề tài: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH


Luận văn dài 53 trang

PHẦN I: GIỚI THIỆU . 1

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3
2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4
2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam 4
2.2.1.1 Trên thế giới . 4
2.2.1.2 Ở Việt Nam 4
2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri 5
2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm . 6
2.3 Chiết tách acid nucleic . 6
2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) . 7


PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 13
3.1 Thời gian và địa điểm 13
3.2 Dụng cụ và hoa chất . 13
3.2.1 Dụng cụ 13
3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn 13
3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR 13
3.2.2 Hóa chất 14
3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn . 14
3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR . 14
3.3 Phương pháp nghiên cứu 15
3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm . 15
3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể . 15
3.3.1.2 Cá thí nghiệm . 15
3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm 15
3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm 16
3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 17
3.3.3 Phương pháp PCR . 19
3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR 19
3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al,
1992) . 19
3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy . 20
3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) . 20
3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) 21
3.3.3.2.3 Điện di 22
3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu 22


PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 24
4.1 Kết quả phân tích vi sinh 24
4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý . 24
4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 24
4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol
chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25
4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol
chloroform (Taggart et al, 1992) 25
4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 26
4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase
27
4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5ml, thời gian ủ
bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5ml, thời gian ủ bước 2 là 30 phút.
27
4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR 28
4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy 28
4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu 30
4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E. ictaluri (Panangala
và ctv, 2007) 31
4.4 Kết quả phản ứng PCR 33
4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid
nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 33
4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách
được tối ưu 35


PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT . 36
5.1 Kết luận . 36
5.2 Đề xuất 36


TÀI LIỆU THAM KHẢO . 37