Luận Văn Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

[TABLE="align: left"]
[TR]
[TD][/TD]
[/TR]
[TR]
[TD][/TD]
[TD][/TD]
[/TR]
[/TABLE]


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO



Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI LĂNG VĂN ĐỨC






Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN



Chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Các Thầy Cô và anh chị tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt giúp.
Chị Đặng Ngọc Thuỳ Dương và chị Lê Thị Kim Phượng đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 31 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận.



Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.







Thủ Đức, tháng 08 năm 2009

Lăng Văn Đức





TÓM TẮT

Đề tài : “Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) trên heo” được thực hiện từ ngày 16/2/2009 đến ngày 16/7/2009, tại Viện Nghiên Cứu Công nghệ Sinh Học và Môi Trường Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh nhằm đánh giá khả năng phát hiện virus PRRS trong huyết thanh heo giữa phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR để lựa chọn phương pháp thích hợp trong xét nghiệm virus PRRS.
Mẫu máu được thu thập trên các heo có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS được chiết lấy huyết thanh để ly trích RNA của virus. Quy trình RT-PCR được dùng để phát hiện RNA của virus PRRS trên các mẫu thu thập. Sử dụng quy trình nested RT-PCR phát hiện RNA của virus PRRS và phân biệt hai kiểu gene virus trên các mẫu vắc-xin và mẫu thu thập.Thiết lập quy trình so sánh khả năng phát hiện RNA của virus PRRS giữa hai phương pháp này.
Khi sử dụng phương pháp RT-PCR đã phát hiện được 12/20 mẫu có kết quả dương tính và 8/20 mẫu có kết quả âm tính. Với phương pháp nested RT-PCR đã phát hiện được 18/20 mẫu có kết quả dương tính và 2/20 mẫu có kết quả âm tính trong những mẫu xét nghiệm. Trong đó, có 2/18 mẫu nhiễm dòng châu Âu, 10/18 mẫu nhiễm dòng Châu Mỹ và 6/18 mẫu nhiễm cả hai dòng. Khi so sánh độ nhạy của hai phương pháp trên mẫu huyết thanh pha loãng thì phương pháp RT-PCR phát hiện được RNA của virus ở độ pha loãng từ 10[SUP]0 [/SUP]đến 10[SUP]-5[/SUP], còn phương pháp nested RT-PCR phát hiện được ở độ pha loãng từ 10[SUP]0 [/SUP]đến 10[SUP]-8[/SUP]. Tám mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR, được kiểm tra bằng nested RT-PCR cho kết quả 6/8 mẫu dương tính.
Độ nhạy của phương pháp nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS cao hơn hẳn phương pháp RT-PCR. Những mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR nên kiểm chứng lại bằng phương pháp nested RT-PCR.




SUMMARY

Thesis: “Using the nested RT-PCR method to detect Porcine reproduction and respiratory syndrome virus (PRRSV) in swine” had been done from 16/2/2009 to 16/7/2009, at Insitute of Biotechnological and environmental research of Nong Lam university Ho Chi Minh city to compare of possibility to detect PRRSV in blood swine between RT-PCR and nested RT-PCR methods to select a suitable method in diagnostic PRRSV.
Blood samples taken from swine suspected of PRRSV infection was extracted to serum to prepare RNA of virus. The RT-PCR protocol was used to determine RNA of PRRSV in collecting samples. The nested RT-PCR protocol was used to determine RNA of PRRSV and distinguish between the European and the American genotypes of the virus in collecting samples and vaccine samples. The comparison procedure was carried out for testing the possibility in detection RNA of PRRSV between these two methods.
The RT-PCR method could determine 12 positive samples in 20 samples, whereas the nested RT-PCR method could determine 18 positive samples in 20 samples. In the results, there were 2/18 samples infected European strain only, 10/18 samples infected American strain only and 6/18 samples infected boths. In compairing the sensitivity of two methods, the RT-PCR method could determine virus RNA from 10[SUP]0[/SUP] to 10[SUP]-[/SUP][SUP]5 [/SUP]RNA extract dilution, the nested RT-PCR method could determine virus RNA from 10[SUP]0[/SUP] to 10[SUP]-[/SUP][SUP]8[/SUP] RNA extract dilution. Eight negative samples of the RT-PCR method were tested again by the nested RT-PCR method and the results showed 6/8 positive samples.
In this research, the sensitivity of the nested RT-PCR method was higher than that of the RT-PCR method to detect RNA of PRRSV. The negative samples of the RT-PCR method should be tested again by the nested RT-PCR method.




MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN . iii
TÓM TẮT . iv
SUMMARY v
MỤC LỤC . vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT . viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG . ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH . x
Chương 1 MỞ ĐẦU . 1