Luận Văn ỨNG DỤNG PHƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊ

TÓM TẮT


PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng

9 – 2005. ỨNG DỤNG PHưƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ

CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN

TRẮNG (Penaeus vannamei).


Giáo viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO.


Đề tài được thực hiện từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005, tại Viện Nghiên Cứu

Nuôi Trồng Thủy Sản II, trên hai đối tượng là TSV trên P. vannamei (Postlarvae và

thương phẩm) và WSSV trên P. monodon (Postlarvae và thương phẩm). Hai loại virus

này có mức độ nguy hiểm và khả năng tạo dịch bệnh lớn ở tôm nuôi tại Việt Nam. Do

đó, chúng tôi sử dụng phương pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai tại chỗ nhằm

mục tiêu phát hiện nhanh và chính xác các mẫu tôm nhiễm bệnh Taura và đốm trắng,

để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát hai loại

dịch bệnh này. Đề tài gồm các thí nghiệm sau:


1. Các thí nghiệm trên P. vannamei


Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phương pháp ISH chẩn

đoán TSV trên P. vannamei. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy

rằng phương pháp ISH được ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán TSV trên P.

vannamei.

Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ưu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm

tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:

Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu, thực hiện trên 5 nghiệm

thức. Kết quả nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe

0 0

được biến tính trước ở 95 C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 4 C;

khi lai thì cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên mẫu và thực hiện

0 0

biến tính mẫu ở 70 C trong 6 phút, sau đó ủ mẫu qua đêm ở 42 C) là tốt

nhất trên postlarvae và tôm thương phẩm.

Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ưu với Proteinase K, thực hiện trên 5

nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút. Kết quả thời

gian cắt với Proteinase K tối ưu trên postlarvae là 15 phút và trên tôm

thương phẩm là 17 phút.

Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực hiện trên 3 nghiệm thức:

100µl, 75µl và 50µl. Kết quả thể tích dung dịch lai thích hợp nhất trên

tôm postlarvae và tôm thương phẩm là 75µl.


2. Các thí nghiệm trên P. monodon


Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phương pháp ISH chẩn

đoán WSSV trên P. monodon. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy


rằng phương pháp ISH được ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán WSSV trên P.

monodon.

Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ưu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm

tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:

Thí nghiệm thay đổi một số hóa chất thông dụng như cồn tuyệt đối,

xylene và paraformaldehyde do Việt Nam và Trung Quốc sản xuất,

nhằm giảm chi phí chẩn đoán. Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự

khác biệt so với thí nghiệm dùng các hóa chất như bộ kit đã khuyến cáo

sử dụng.

Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực hiện trên cả tôm

postlarvae và thương phẩm, kết quả lai thực hiện theo quy trình này

không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.

Thí nghiệm biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trước khi lai:

thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm và thu được kết quả

không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.

Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe và mẫu đồng

thời trên lame: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm và thu

được kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.


3. Thí nghiệm so sánh phương pháp ISH với mô học và PCR


Thí nghiệm được thực hiện trên P. vannamei (postlarvae và tôm thương phẩm)

và P. monodon (postlarvae và tôm thương phẩm). Kết quả thí nghiệm cho thấy phương

pháp ISH có độ ổn định, độ chính xác và nhạy hơn mô học và PCR.

Từ các kết quả thực nghiệm như trên, chúng tôi đã đưa ra quy trình ISH có độ

nhạy, độ ổn định, độ chính xác cao và thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng được việc

kiểm tra các mầm bệnh do WSSV và TSV gây ra trên tôm nuôi trong điều kiện phòng

thí nghiệm và trong các hệ thống nuôi tôm ở Việt Nam.


MỤC LỤC


CHưƠNG TRANG


Trang bìa i


Trang tựa ii


Lời cảm tạ iii


Tóm tắt .iv


Mục lục vi


Danh sách các chữ viết tắt .xi


Danh sách các hình và các sơ đồ .xii


Danh sách các bảng .xiv


CHưƠNG I: GIỚI THIỆU .1


I.1 Đặt vấn đề .1


I.2 Mục tiêu đề tài 2


I.3 Yêu cầu của đề tài 2


I.4 Nội dung của đề tài 2


CHưƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3


II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới .3


II.1.1 Hiện trạng chung 3


II.1.2 Các hình thức nuôi .3


II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới .3


II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 4


II.2.1 Hiện trạng chung 4


II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang được áp dụng 5


II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam 5


II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng .5


II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P. monodon và tôm thẻ chân trắng P. vannamei 5


II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng .6


II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú .6


II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng 7


II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng .7


II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú .7


II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng 7


II.3.4 Dinh dưỡng 7


II.3.4.1 Dinh dưỡng của tôm sú .7


II.3.4.2 Dinh dưỡng của tôm thẻ chân trắng 8


II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển .8


II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) 8


II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD 8


II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh 8


II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý .11


II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh 11


II.4.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh .12


II.4.1.5 Phòng bệnh .12


II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 12


II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh 12


II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý .13


II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh .14


II.4.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh .14


II.4.2.5 Phòng và trị bệnh 14


II.5 PHưƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION .14


II.5.1 Sơ lược về phương pháp In situ hybridization .14


II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử 15


II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử .16


II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA .16


II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA .16


II.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử .17


II.5.5 Probe 17


II.5.5.1 Khái niệm 17


II.5.5.2 Các loại probe 18


II.5.5.3 Các phương pháp đánh dấu probe .18


II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai .19


II.5.6 Các phương pháp lai tại chỗ ISH .23


II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc .23


II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể 23


II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô 24


II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH 25


II.5.8 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng


phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản 25


II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura 25


II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi


thủy sản 26


II.5.9 Xu hướng phát triển của phương pháp này 26


CHưƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 27


III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 27


III.2 Vật liệu sinh học 27


III.3 Hóa chất thí nghiệm .27


III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ .27


III.3.2 Hóa chất cần thiết nhưng không có trong bộ kit chẩn đoán .28


III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 28


III.4.1 Thiết bị thí nghiệm .28


III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm 29


III.5 Phương pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit .29


III.5.1 Chuẩn bị hóa chất .29


III.5.2 Chuẩn bị mẫu 30


III.5.2.1 Cố định mẫu 30


III.5.2.2 Cách xử lý mẫu 30


III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin .31


III.5.2.4 Cắt mẫu 31


III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit .31


III.5.3.1 Ngày thứ nhất 31


III.5.3.2 Ngày thứ hai 32


III.6 Phương pháp nghiên cứu .34


III.6.1 Phương pháp thu mẫu .34


III.6.2 Bố trí thí nghiệm .34


III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng


Penaeus vannamei .35


III.6.2.2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus


monodon 36


III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với mô học và PCR .39


CHưƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .41


IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei .41


IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phương pháp ISH .41


IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phương pháp ISH trên P. vannamei .43


IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai .43


IV.1.2.2 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K .46


IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp .49


IV.2 Kết quả trên tôm sú P. monodon .52


IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phương pháp 52


IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV áp dụng trong


phòng thí nghiệm .54


IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một số


hóa chất thông dụng không có trong bộ kit .54


IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh 56


IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai .59


IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe


trước khi lai 61


IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa ISH với mô học và PCR .65


IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei .65


IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae 65


IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm 66


IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon 68


IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae 69


IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm .70


IV.5 Nhận xét chung 73


IV.6 Những thuận lợi và khó khăn 74


IV.6.1 Thuận lợi 74


IV.6.2 Khó khăn 74


IV.7 ưu nhược điểm của phương pháp In situ hybridization 75


IV.7.1 ưu điểm .75


IV.7.2 Nhược điểm .75


CHưƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .76


V.1 Kết luận .76


V.1.1 Phương pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV trên P.


vannamei 76


V.1.2 Phương pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P.


monodon 76


V.2 Đề nghị 77


CHưƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 79