Luận Văn ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VAØ EXTRA SMALL VIRUS (

TÓM TẮT


Tôm càng xanh là một trong những đối tượng nuôi quan trọng của ngành nuôi


trồng thủy sản. Ở Châu Á tôm càng xanh được mở rộng và tăng cường nuôi với qui mô


công nghiệp ở một số nước như Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, các nước


này chiếm sản lượng lớn tôm càng xanh của cả thế giới. Sự mở rộng và tăng cường


nuôi tôm càng xanh đã làm phát sinh nhiều bệnh mới. Một trong những bệnh mới được


ghi nhận gần đây xuất hiện trong những bể ương tôm càng xanh gây thiệt hại cho


ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn Độ, sau đó xuất hiện ở Đài Loan và 5 tỉnh


thuộc Trung Quốc. Bệnh này có biểu hiện hơi trắng ở đuôi nên được gọi là “bệnh trắng


đuôi ”. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium


rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV).


Hiện nay, trong các bể ương tôm càng xanh ở Việt Nam xuất hiện dấu hiệu


lâm sàng hơi trắng ở đuôi, các bể này có tỷ lệ chết rất cao. Để xác định nguyên nhân


gây chết trong các bể ương có phải là do MrNV và XSV gây ra hay không. Chúng tôi


tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR của Widada và Sahul Hameed để xác


định có hay không sự hiện diện MrNV và XSV trong mẫu bệnh nghi ngờ là bệnh trắng


đuôi.


Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tôi đạt được


có kết quả như sau:


Xác định được sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tôm thịt


bệnh trắng đuôi được cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR


Khảo sát được hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và


Trizol trên mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR.


Khảo sát được nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT-


PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.


Khảo sát được nhiệt độ lai tối ưu của hai virus cho phản ứng Single - Step


0

PCR là 55 C.


Ứng dụng qui trình khảo sát được trên 50 mẫu tôm càng xanh thu từ thực


địa, kết quả phát hiện được 6 mẫu tôm mẹ, 1 mẫu tôm postlarvae có sự hiện diện đồng


thời của MrNV và XSV trong mẫu tôm bệnh trắng đuôi.



Mục lục


Lời cảm ơn . iii


Abstract iv


Tóm tắt .v


Mục lục vi


Danh mục các hình và các bảng . ix


Danh mục các từ viết tắt x


PHẦN 1. LỜI MỞ ĐẦU 1


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3


2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG


XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3


2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới . 3


2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam 3


2.2. MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH . 5


2.2.1. Bệnh hoại tử cơ . 5


2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng 5


2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn 5


2.2.4. Bệnh phát sáng 5


2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ . 6


2.2.6. Bệnh do Protozoa 6


2.2.7. Bệnh virus . 6


2.2.8. Bệnh trắng đuôi 6


2.3. NHỮNG PHưƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRẮNG ĐUÔI


DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG 10


2.3.1. Phương pháp mô học 10


2.3.2. Phương pháp lai Dot-lot 10


2.3.3. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) 11


2.3.4. Phương pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked


immunosorbent assay) .12


2.3.5. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 12


2.3.6. Phương pháp RT -PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) .15


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP


3.1. NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 18


3.2. VẬT LIỆU . 18


3.2.1. Mẫu tôm 18


3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình . 18


3.2.3. Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) 19


3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit . 19


3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) 20


3.2.6. Hoá chất khác 20


3.2.7. Dụng cụ và thiết bị 21


3.3. PHưƠNG PHÁP . 21


3.3.1. Phương pháp tách chiết RNA virus 21


3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol 21


3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) 22


3.3.2. Phương pháp Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV 22


3.3.3. Phương pháp điện di nucleic acid trên gel agarose 23


3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 24


3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát hiện MrNV, XSV từ


mẫu tôm bệnh (chứng dương) được cung cấp từ Ấn Độ 24


3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT-PCR . 24


3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và


AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad) .24


3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi


3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi 25


3.4.3. Ứng dụng qui trình khảo sát được kiểm tra một số mẫu tôm càng xanh thu thực


địa .25


PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN


4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT


HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐưỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ. 26


4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE -


STEP RT - PCR . 27


4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết. 27


4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi 30


4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 30


4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐưỢC KIỂM TRA MỘT SỐ


MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA .32


PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ


5.1. Kết luận . 36


5.2. Tồn tại . 36


5.3. Đề xuất 37


TÀI LIỆU THAM KHẢO


Tiếng Việt 38


Tiếng nước ngoài 39