Thạc Sĩ ứng dụng kỹ thuật qf-pcr vào phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trước sinh trên mẫu ga

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trẻ có rối loạn nhiễm sắc thể (NST) thường bị đa dị tật, chậm phát triển tâm thần vận động, bất thường cơ quan sinh dục, vô sinh. Các bất thường NST gặp ở trẻ sinh ra sống hầu hết liên quan đến NST 21, 18, 13 và các NST giới tính. Lệch bội NST 21, 18, 13, X và Y chiếm đến 90% các bất thường về lệch bội và chiếm 65% trong tổng các bất thường NST. Các dị tật này lại không điều trị được nên cách duy nhất là tầm soát và chẩn đoán trước sinh nhằm tư vấn cho thai phụ để có biện pháp cần thiết, kịp thời giúp giảm tỉ lệ những trẻ bệnh tật này được sinh ra.
Từ năm 1966, kỹ thuật karyotype ra đời nhằm phát hiện các bất thường về cấu trúc, số lượng bộ NST và được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh. Tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là thời gian trả kết quả dài, từ 14 – 21 ngày nên một số phương pháp chẩn đoán nhanh ra đời nhằm khắc phục nhược điểm này như kỹ thuật
FISH (Fluorescence in situ Hybridization), MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction). Trong đó thì kỹ thuật QF-PCR có ưu điểm vượt trội là có thể tự động hóa cùng lúc nhiều mẫu, tốn ít nhân công lao động, chi phí xét nghiệm thấp và thời gian trả kết quả nhanh, chỉ từ 24 – 36 giờ kể từ lúc nhận mẫu. Từ năm 1993, QF-PCR đã được ứng dụng vào chẩn đoán nhanh lệch bội một số NST chọn lọc. Ở Việt Nam, quy trình sàng lọc trước sinh qua siêu âm, xét nghiệm máu và chẩn đoán các bất thường NST qua chọc hút ối vào ba tháng giữa thai kỳ đã được triển khai tại nhiều nơi nhưng chưa có trung tâm nào thực hiện quy trình chẩn đoán xác định sớm các bất thường thai ở ba tháng đầu thai kỳ. Chẩn đoán sớm vào giai đoạn đầu thai kỳ không những giúp ích cho tâm lý của thai phụ và người nhà khi chờ đợi kết quả mà còn đảm bảo an toàn cho sức khỏe của người mẹ trong trường hợp phải chấm dứt thai kỳ. Ngoài ra, việc triển khai sàng lọc máu mẹ và đo khoảng sáng sau gáy ở ba tháng đầu thai kỳ trong tầm soát các bất thường tại bệnh viện Từ Dũ (BVTD) để sàng lọc các nhóm thai phụ có thai kỳ nguy cơ cao tạo tiền đề cho việc chẩn đoán xác định các bất thường vào giai đoạn sớm.
Nhằm mang lại tiện ích cho thai phụ và gia đình, thu ngắn thời gian chờ đợi kết quả và cho phép chấm dứt thai kỳ ở thời điểm an toàn và kín đáo, chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh các lệch bội NST trong ba tháng đầu thai kỳ.

MỤC LỤC
Lời cảm ơn . i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .vi
DANH MỤC BẢNG . vii
DANH MỤC HÌNH . viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ .ix
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU . 3
1.1. Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp . 4
1.1.1. Hội chứng Down 4
1.1.2. Hội chứng Edwards 5
1.1.3. Hội chứng Patau . 6
1.1.4. Các rối loạn nhiễm sắc thể giới tính 6
1.2. Các phương pháp tầm soát dị tật bẩm sinh trong ba tháng đầu thai kỳ 8
1.2.1. Dựa trên yếu tố tuổi mẹ 8
1.2.2. Siêu âm đo khoảng mờ gáy . 9
1.2.3. Xét nghiệm double test . 9
1.3. Các phương pháp lấy mẫu trong chẩn đoán trước sinh . 11
1.3.1. Chọc hút dịch ối 11
1.3.2. Sinh thiết gai nhau 12
iii
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Nguyễn An Phú
1.3.3. Chọc hút máu cuống rốn . 12
1.3.4. Sinh thiết mô thai và nội soi thai . 13
1.3.5. Phân lập tế bào và DNA của thai trong máu mẹ 13
1.4. Các kỹ thuật chẩn đoán rối loạn nhiễm sắc thể . 14
1.4.1. Kỹ thuật karyotype . 14
1.4.2. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang . 14
1.4.3. Kỹ thuật MLPA 15
1.4.4. Kỹ thuật CGH . 16
1.4.5. Kỹ thuật Array CGH . 16
1.4.6. Kỹ thuật QF-PCR . 17
1.5. Giới thiệu về gai nhau 19
1.5.1. Khái niệm . 19
1.5.2. Sinh thiết gai nhau 20
1.5.3. Lịch sử chẩn đoán trước sinh trên mẫu gai nhau . 22
1.5.4. Bất lợi của gai nhau trong chẩn đoán trước sinh 23
1.6. Thông tin về bộ kit Devyser . 24
Chương 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 26
2.1. Thiết bị 26
2.2. Phương pháp thực hiện 28
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1. Vật liệu sinh học . 29
2.3.2. Xử lý gai nhau sau sinh thiết . 29
iv
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Nguyễn An Phú
2.3.3. Nuôi cấy tế bào gai nhau . 30
2.3.4. Thu hoạch và nhuộm băng nhiễm sắc thể 31
2.3.5. Ly trích DNA từ gai nhau . 33
2.3.6. Lựa chọn nồng độ DNA thích hợp 33
2.3.7. Muliplex PCR khuếch đại các STR đặc trưng cho NST 13, 18, 21 và X, Y . 34
2.3.8. Kỹ thuật FISH 43
2.4. Vấn đề về Y đức 44
Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 45
3.1. Đặc điểm của thai phụ và thai 45
3.1.1. Tuổi mẹ 45
3.1.2. Đặc điểm thai kỳ . 45
3.2. Kết quả tối ưu hóa kỹ thuật QF-PCR . 47
3.2.1. Nồng độ DNA thích hợp . 47
3.2.2. Quy trình điện di mao quản . 49
3.3. Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF-PCR . 49
3.4. Trường hợp không kết luận từ mẫu gai nhau bằng kỹ thuật QF-PCR . 54
3.5. Kết quả kỹ thuật karyotype 57
3.5.1. Kết quả nuôi cấy tế bào gai nhau 57
3.5.2. Kết quả kỹ thuật karyotype . 58
3.6. Kết quả chẩn đoán lệch bội 60
3.7. Độ dị hợp tử của các locus STR . 61
3.8. Mối tương quan giữa kết quả chẩn đoán và các yếu tố nguy cơ 63
v
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Nguyễn An Phú
3.8.1. Mối tương quan giữa tuổi mẹ và kết quả chẩn đoán 63
3.8.2. Mối tương quan giữa khoảng mờ gáy và kết quả chẩn đoán 64
3.8.3. Mối tương quan giữa nguy cơ sinh hóa và kết quả chẩn đoán . 64
3.8.4. Tổng hợp mối tương quan giữa các nguy cơ chọn mẫu và kết quả chẩn đoán
. 67
Chương 4. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ . 69
4.1. Kết luận . 69
4.2. Đề nghị 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO x
Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân xix
Phụ lục 2. Một số kết quả QF-PCR . xxvii
Phụ lục 3. Một số kết quả Karyotype . xxxi