Chuyên Đề Ứng dụng kỹ thuật nested rt - pcr xác định đột biến gen bcr/abl ở bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch

Đề tài: Ứng dụng kỹ thuật nested rt - pcr xác định đột biến gen bcr/abl ở bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt
Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt là chuyển đoạn t(9;22) (q34;q11). Trong chuyển đoạn này gen tiền ung thư c - abl trên nhiễm sắc thể số 9 nối với gen bcr trên nhiễm sắc thể số 22. Điểm đứt gãy trên gen c - abl ở intron đầu tiên, điểm đứt gãy trên gen bcr có thể ở 1 trong 3 vùng. Tuỳ vào vị trí đứt gãy trên gen bcr mà gen bcr/abl sẽ có các sản phẩm khác nhau: b3a2, b2a2, b3a3, b2a3, e1a2, e1a19 Hai kiểu đột biến b3a2 và b2a2 chiếm phần lớn ở các bệnh nhân CML giai đoạn mạn tính. [3, 4]. Đột biến e1a2 thường gặp ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho mang chuyển đoạn t(9;22) nhưng rất ít gặp ở bệnh nhân CML giai đoạn mạn tính. Trên thế giới, các kỹ thuật sinh học phân tử (RT - PCR, Nested RT - PCR, FISH, multiplex PCR) đã được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh CML, đặc biệt với sự ra đời của thuốc Gleevec, một loại thuốc được coi là chữa khỏi bệnh CML, tác dụng hoàn toàn đánh vào cơ chế bệnh sinh của bệnh CML, do đó chỉ có tác dụng điều trị trên bệnh nhân mang gen bcr/abl. Rõ ràng việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử mang lại nhiều những lợi ích lớn, có tầm quan trọng trong chẩn đoán và quyết định điều trị, tiên lượng bệnh máu, nhưng hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều những công trình nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật này ở bệnh nhân mắc bệnh máu. Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành nhằm mục tiêu:
Bước đầu áp dụng kỹ thuật Nested RT - PCR phát hiện đột biến gen bcr/abl ở bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt.
I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tách chiết RNA và tổng hợp DNA bổ sung (cDNA): Tách bạch cầu từ 1ml máu đã chống đông bằng dung dịch EDTA bằng cách ly tâm với dung dịch ly giải hồng cầu (Red blood Cell Lysis Solution). Dùng 100 àl BC để tách chiết RNA theo quy trình của hãng Promega cung cấp. Tất cả các bước được thực hiện trong buồng xử lý vô trùng. RNA tách chiết được hoà tan trong 50 àl nước cất cất giữ ở - 300C cho đến khi sử dụng.
Kỹ thuật Nested RT - PCR gồm 2 bước: Trước tiên tiến hành kỹ thuật RT - PCR, tiếp theo là kỹ thuật là nested PCR.
- Kỹ thuật RT - PCR: Để tổng hợp DNA bổ sung (cDNA) từ khuôn mẫu là RNA: Sử dụng 10àl RNA, 25àl RT - PCR Mastermix 2X, 3àl MgSO4 25mM, 0,5àl mồi BCR - b1 - A, 0,5àl mồi BCR - a3 - B, 1àl AMV reverse transcriptase, 10àl nước cất. Trộn đều mẫu RNA với các hoá chất trên, đưa hỗn hợp vào tiến hành phản ứng RT - PCR theo
0 0
1. Đối tượng nghiên cứu
30 bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt giai đoạn mạn tính, được chẩn đoán lần đầu tiên, chưa điều trị hoá chất.
2. Phương pháp nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt bằng tiêu chuẩn lâm sàng và huyết tuỷ đồ, xét nghiệm di truyền tế bào tìm nhiễm sắc thể Ph1, sau đó sử dụng kỹ thuật
Nested RT - PCR tìm đột biến gen bcr/abl. chu kỳ nhiệt 45 C: 45 phút (1 chu kỳ), 95 C: 2
phút (1 chu kỳ), 940C: 30 giây (35 chu kỳ), 650C: 1 phút (35 chu kỳ), 750C: 1 phút (35 chu kỳ).
- Kỹ thuật nested PCR: 6àl sản phẩm cDNA thu được từ phản ứng RT - PCR ở trên trộn với 25àl PCR Mastermix 2X, 2àl MgSO4 25mM, 0,5àl primer BCR - b2 - C, 0,5àl primer BCR - a3 - D, 16àl nước cất. Sau đó tiến hành phản ứng Nested PCR theo chu kỳ nhiệt 950C: 1 phút (1 chu kỳ), 940C: 30 giây (35 chu kỳ), 650C: 1 phút (35 chu
kỳ), 720C: 1 phút (35 chu kỳ).
Gen bcr/abl có ý nghĩa rất lớn trong chẩn đoán bệnh lơ xê mi dòng bạch cầu hạt. Mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật Nested RT - PCR phát hiện những đột biến gen b3a2, b2a2, e1a2, b2a3, b3a3 ở bệnh nhân CML Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Sử dụng kỹ thuật Nested RT - PCR phân tích trên mẫu máu ngoại vi của 30 bệnh nhân CML Kết quả: 28/30 bệnh nhân có gen bcr/abl; 20/30 bệnh nhân có đột biến gen b3a2, 5/30 bệnh nhân có đột biến gen b2a2, có 2/30 bệnh nhân biểu hiện phối hợp b3a2 và b2a2, 1/30 bệnh nhân có đột biến gen e1a2, 2/30 bệnh nhân âm tính. Kết luận: Hầu hết có đột biến gen b3a2, còn lại là đột biến gen b2a2 hoặc phối hợp b3a2/b2a2, 1 trường hợp có đột biến gen e1a2, 2 bệnh nhân âm tính. Không có trường hợp nào biểu hiện kiểu đột biến b3a3 hoặc b2a3.