Luận Văn Ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lậ

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Ghi nhận được khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng; khuẩn lạc trắng trên CT-SMAC. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt. Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó.
(2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae). Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy.
(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli.
(4) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo.
SUMMARY

“Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef”

The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9 swabs of the beef surface by multiplex – PCR. Observation had one group of pink colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on CT-SMAC. Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the colony groups and each separate colony were extracted by heat method. The results of multiplex – PCR were showed that:
(1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have the genes.
(2) Frequency of virulence genes of isolated E. coli from diarrhea stools samples was 25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae).
(3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E. coli.
(4) Sta gene of E. coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples weren’t detected.

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi

1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2. TỔNG QUAN 3
2.1. Vi khuẩn E. coli 3
2.1.1. Định nghĩa 3
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên 4
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli 4
2.1.5. Phân loại E. coli 4
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC 4
2.1.5.2. Nhóm EPEC 7
2.1.53. Nhóm ETEC 8
2.2. Kỹ thuật PCR 11
2.2.1. Nguyên tắc 11
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR 12
2.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR 14
2.2.4. Phân tích kết quả PCR 15
2.2.5. Những ứng dụng của PCR 15
2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ 15
2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng 16
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA 16
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau 17
2.2.6. Các hạn chế của PCR 17
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 19
3.2. Nội dung 19
3.3. Phương pháp nghiên cứu 19
3.3.1. Lấy mẫu 19
3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli 20
3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của
E. coli phân lập được 23
3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di 25
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc
phân lập được 27
4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường
thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC 27 4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn. 27
4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bò tiêu chảy 28
4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân heo tiêu chảy 32
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bê tiêu chảy 36
4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò 38
4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát 39
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1. Kết luận 41
5.2. Đề nghị 41
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
7. PHỤ LỤC 46

“ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.