Thạc Sĩ ứng dụng kỹ thuật mlpa (multiplex ligation dependent probes amplification) trong xác định kiểu haplo

Giới thiệu

Salmonella Typhi là nguyên nhân chính gây bệnh sốt thương hàn ở Việt Nam và trên thế giới. Theo thống kê, số ca nhiễm hàng năm lên đến 16-33 triệu ca với khoảng 500.000-600.000 người chết [9]. Bệnh lây truyền qua đường phân-miệng nên rất phổ biến ở các nước đang phát triển, đặc biệt ở các nước Châu Á và Châu Phi [109]. Kháng sinh là biện pháp hiệu quả nhất trong điều trị sốt thương hàn. Tuy nhiên tình hình kháng thuốc lan tràn và không ngừng gia tăng hiện nay của S.Typhi gây rất nhiều khó khăn trong điều trị [70]. Nghiêm trọng hơn là sự gia tăng của quần thể S.Typhi đa kháng thuốc (kháng với chloramphenicol, ampicillin và co-trimoxazole) kết hợp kháng nalidixic acid.
So với những chủng nhạy thì những chủng đa kháng thuốc gây bệnh nặng hơn; tỉ lệ biến chứng và tử vong cao hơn đặc biệt ở trẻ em dưới 2 tuổi và giới hạn kháng sinh điều trị [109]. Không những thế, tỉ lệ mang S.Typhi mãn tính sau điều trị còn cao hơn gấp 10 lần so với sốt thương hàn gây ra bởi chủng nhạy [70]. S.Typhi kháng nalidixic acid (kháng sinh thế hệ I thuộc họ quinolone) gây giảm nhạy với fluoroquinolone, là họ kháng sinh chủ yếu trong điều trị sốt thương hàn hiện nay. Sự giảm nhạy với fluoroquinolone của các chủng S.Typhi thường dẫn đến việc điều trị kéo dài, nguy cơ thất bại cao và tăng gánh nặng điều trị [3, 8, 33, 49, 59, 78, 82].
Do đó, sốt thương hàn gây ra do các chủng S.Typhi đa kháng kết hợp kháng nalidixic acid đang được quan tâm hiện nay ở nhiều nước đang phát triển. Nghiên cứu về dịch tễ cũng như cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi là rất quan trọng và cần thiết để tìm hiểu sự lây lan, ngăn chặn sự bùng phát của bệnh trong tương lai và có phát đồ điều trị hợp lý. Tuy nhiên, các nghiên cứu đều gặp nhiều khó khăn do chủng S.Typhi có tính tương đồng di truyền cao. Vi khuẩn này rất ổn định về mặt di truyền, mức độ đa dạng trình tự thấp, khi so sánh một vài trình tự gen thường không phân biệt được các dòng S.Typhi [54]. Do đó để phân biệt các chủng S.Typhi cần phải có những phương pháp nghiên cứu sâu hơn.
Với sự phát triển không ngừng của kỹ thuật giải trình tự tự động thì SNP typing (Single Nucleotide Polymorphism typing)- phương pháp phân biệt dựa vào sự đa hình các trình tự nucleotide được xem là phương pháp chuẩn hiện nay. Tuy nhiên phương pháp này rất tốn kém, đòi hỏi thời gian và thiết bị kỹ thuật đắt tiền nên không thể áp dụng ở những vùng dịch tễ của sốt thương hàn thường là những vùng kinh tế thấp.

Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi muốn phát triển một phương pháp giúp xác định nhanh các kiểu di truyền của S.Typhi một cách đơn giản, có hiệu quả phân biệt cao, lặp lại. Phương pháp này có thể được áp dụng tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử thông thường ở Việt Nam cũng như các nước đang phát triển. Phương pháp này hứa hẹn sẽ trở thành công cụ hiệu quả trong các nghiên cứu về dịch tễ học giúp tìm hiều nguồn gốc lây lan của dịch bệnh, con đường lan truyền, tìm hiểu mối quan hệ giữa kiểu gen với vùng địa lý, mối quan hệ giữa kiểu gen với kiểu hình kháng thuốc; nguồn gốc và sự tiến hóa các kiểu gen khác nhau ở S.Typhi Ngoài ra phương pháp còn giúp xác định cấu trúc di truyền trong quần thể S.Typhi ở những vùng nhất định, điều mà trước đây hầu như không thể tiếp cận bằng các phương pháp thông thường.

MỤC LỤC

Lời Cảm ơn
Mục lục .i
Danh mục các chữ viết tắt
iv
Danh mục các bảng v
Danh mục các hình vẽ .vi
Giới thiệu .vii
Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài viii
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi (S.Typhi) . 2
1.2. Đặc điểm cấu trúc và sinh lý, sinh hóa của S.Typhi 3
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc . 4
1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 5
1.3. Phương pháp phân lập và định danh S.Typhi . 5
1.4. Đặc điểm di truyền của S.Typhi . 6
1.5. Bệnh học sốt thương hàn do S.Typhi . 7
1.5.1. Nguồn lây bệnh và con đường truyền nhiễm 7
1.5.2. Triệu chứng lâm sàng . 7
1.5.3. Sự phát sinh bệnh do S.Typhi . 8
1.5.4. Phòng bệnh sốt thương hàn 8
1.5.5. Điều trị sốt thương hàn . 10
1.6. Tình hình kháng kháng sinh hiện nay của S.Typhi và dịch tễ học sốt
thương hàn trên thế giới và Việt Nam 10
1.6.1. Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn
trên thế giới 10
1.6.2. Tình hình kháng kháng sinh của S.Typhi và dịch tễ học sốt thương hàn tại Việt Nam 13
1.7. Các phương pháp phân biệt S.Typhi trong nghiên cứu dịch tễ và tìm hiểu cấu trúc di truyền của quần thể S.Typhi 14
1.7.1. Các phương pháp cổ điển dựa trên kiểu hình . 14
1.7.2. Các phương pháp phân tử dựa vào DNA . 16
1.8. Phát triển phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) trong phân biệt các chủng S.Typhi 20
1.8.1. Giới thiệu phương pháp MLPA 20
1.8.2. Nguyên tắc của MLPA . 22
1.8.3. Ưu điểm của kỹ thuật MLPA . 23
1.9. Golden gate SNP typing . 23
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cứu . 26
2.2 Qui trình thực nghiệm 26
2.3 Hóa Chất – Thiết Bị - Phương Pháp Tiến Hành 26
2.3.1 Định danh vi khuẩn 27
2.3.1.1. Định danh bằng các thử nghiệm sinh hóa cơ bản . 27
2.3.1.2. Định danh sinh hóa bằng Kít Api 20E (Biomerieux, Paris, Pháp). 29
2.3.1.3. Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên–kháng thể 30
2.3.2. Xác định kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum inhibitory concentration) . 32
2.3.3. Tách chiết DNA bộ gen S.Typhi bằng Wizard (Promega ) Kít 34
2.3.4. SNP typing bằng Golden gate Assay 35
2.3.5. Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification (MLPA) . 35
2.3.5.1. Thiết kế mẫu dò 35
2.3.5.2. Quá trình thực hiện MLPA . 38
2.3.5.3. Phân tích sản phẩm MLPA . 39
2.3.6. PCR thông thường 42
2.3.7. Dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree) từ dữ liệu SNP typing và dữ liệu MLPA) 43
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả xác nhận S.Typhi bằng các phản ứng sinh hóa và Kít Api 20E . 44
3.2. Kết quả kháng sinh đồ và MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của các chủng
S.Typhi phân lập ở Việt Nam và các nước Châu Á 44
3.2.1. Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng
S.Typhi phân lập ở Việt Nam 45
3.2.2. Tỉ lệ đa kháng thuốc và kháng nalidixic acid (Na) của các chủng
S.Typhi phân lập ở một số nước Châu Á 46
3.2.3 . Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với OFX
(ofloxacin) và CIP (ciprofloxacin) của các chủng S.Typhi phân lập từ
Việt Nam và các nước Châu Á 48
3.2.4. Đánh giá giới hạn kháng-nhạy (breakpoint) với ciprofloxacin và ofloxacin theo hướng dẫn của CLSI hiện nay: 49
3.3. Kết quả SNP typing bằng Golden gate assay 52
3.4. Kết quả phân loại các chủng S.Typhi bằng phương pháp MLPA 54
3.4.1 Kết quả phát hiện các đoạn gắn chèn-bị mất của S.Typhi bằng MLPA . 54
3.4.2. Kiểm tra độ chính xác của phương pháp MLPA trên các chủng chứng 56
3.4.3. So sánh kết quả xác định haplotype của S.Typhi bằng Golden gate SNP typing và MLPA 57
3.4.4. Kết quả phân tích sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của 217
S.Typhi bằng phương pháp MLPA . 60
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN 65
4.2 ĐỀ NGHỊ 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC