Tiến Sĩ Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát các tổ hợp gien thường gặp trong bệnh lý bạch cầu cấp

LUẬN ÁN THẠC SỸ Y HỌC
NĂM 2013

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv
Danh mục các bảng viii
Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Di truyền phân tử và ý nghĩa trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 4
1.2. Di truyền phân tử và ý nghĩa trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 17
1.3. Nguyên tắc và ứng dụng của các kỹ thuật sinh học phân tử 27
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.1. Thiết kế nghiên cứu 35
2.2. Đối tượng nghiên cứu 35
2.3. Phương pháp nghiên cứu 36
2.4. Phân tích số liệu 51
2.5. Vấn đề y đức 52

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1. Đặc điểm chung của quần thể nghiên cứu 53
3.2. Các tổ hợp gien lúc mới chẩn đoán 58
3.3. Theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RT-PCR 71
3.4. Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị 72

Chương 4: BÀN LUẬN 84
4.1. Đặc điểm chung của quần thể nghiên cứu 84
4.2. Các tổ hợp gien lúc mới chẩn đoán 86
4.3. Theo dõi điều trị bằng kỹ thuật RT-PCR 95
4.4. Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị 98
4.5. Ưu điểm và hạn chế của nghiên cứu 103
KẾT LUẬN 105
KIẾN NGHỊ 106
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ xii
TÀI LIỆU THAM KHẢO xiii
PHỤ LỤC xxviii

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạch cầu cấp (BCC) là bệnh lý ác tính của hệ tạo máu được đặc trưng
bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. BCC được chia
thành 2 nhóm chính là BCC dòng tủy (BCCDT) và BCC dòng lympho (BCCDL).
Trước đây, việc chẩn đoán và phân loại bệnh bạch cầu cấp hoàn toàn dựa trên hình
thái học và nhuộm hóa tế bào theo tiêu chuẩn phân loại của FAB (French –
American - British) [9], [30]. Gần đây, trên thế giới, việc xác định dấu ấn miễn dịch
bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy (Flow Cytometry) đã được dùng nhằm phân loại
các phụ nhóm của BCC như: BCC dòng lympho B (BCCDL-B), BCC dòng lympho
(BCCDL-T) và BCCDT, đặc biệt là những trường hợp không biệt hóa [23].
Ngày nay, những bất thường về di truyền tế bào và về gien được tìm thấy trong
hầu hết các bệnh ung thư máu. Tế bào bệnh bạch cầu có thể mang những bất thường
nhiễm sắc thể (NST) khác nhau bao gồm những thay đổi về số lượng NST như tăng
số lượng bộ NST hay giảm số lượng bộ NST, 3 NST và những thay đổi về cấu trúc
NST như mất đoạn, đảo đoạn và chuyển đoạn NST.
Trong BCCDT, 4 chuyển vị NST thường gặp là t(8;21), t(15;17), t(9;11) và
inv(16)/t(16 ;16) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien AML1/ETO [35], [88], PML/RARA [27],,
MLL/AF9 [19] và CBFB/MYH11 [89] tương ứng gặp trong 25-30% bệnh nhân. Bên
cạnh đó, trong BCCDL, 4 chuyển vị NST thường gặp là t(1;19), t(4;11), t(12;21) và
t(9;22) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gien E2A/PBX1 [62], [96], MLL/AF4 [29], [149],
TEL/AML1 [72] và BCR/ABL [80] tương ứng gặp trong 30-35% bệnh nhân.
Sự nhận dạng gien BCR và ABL trong chuyển đoạn t(9;22) tiêu biểu cho
bước ngoặc quan trọng khác trong việc thiết lập cơ sở di truyền trong bệnh bạch
cầu [124]. Nhiều nghiên cứu sau đó đã xác lập cơ sở phân tử cho những bất thường
NST đặc trưng trong bệnh bạch cầu. Ngoài việc cung cấp những đầu mối về
nguyên nhân bệnh bạch cầu, những tiến bộ như thế có ý nghĩa quan trọng trong
việc xử trí bệnh [14].
Có nhiều phương pháp để phát hiện các bất thường về di truyền tế bào như
phân tích NST đồ, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence In Situ
Hybridization), lai so sánh bộ gien (CGH: Comparative Genomic Hybridization),
SKY (Spectral Karyotyping), M-FISH (Multiplex- Fluorescence In Situ
Hybridization) hoặc CGH microarray, gọi là kỹ thuật di truyền tế bào phân tử. Ngoài
ra, còn có kỹ thuật khuếch đại gien phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse
Transcriptase Polymarase Chain Reaction). Với những ưu điểm như độ nhạy cao
(có khả năng phát hiện 1 tế bào ác tính trong 10.000 – 1.000.000 tế bào) [17], [115],
[144], phát hiện được những chuyển đoạn NST khó được phát hiện bằng kỹ thuật
NST đồ do kích thước NST không thay đổi rõ như t(12;21)(p13;q22) [121] đồng
thời cho kết quả nhanh nên kỹ thuật RT-PCR ngày càng trở thành công cụ quan
trọng trong chẩn đoán các bất thường về NST và gien cho bệnh nhân ung thư máu.
Tại Việt Nam, nhiều nhà khoa học đã thực hiện khá nhiều nghiên cứu về ung
thư, từ dịch tễ cho đến điều trị. Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di
truyền trong phân tích các bất thường NST trong chẩn đoán và điều trị bệnh lý bạch
cầu cấp còn rất hạn chế. Trước đây, chỉ có vài báo cáo ứng dụng kỹ thuật phân tích
di truyền tế bào kinh điển để phát hiện bất thường NST Philadelphia (Ph) trong
bệnh BCMDT, nhưng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu trên số lượng nhỏ bệnh
nhân, chưa được áp dụng thường qui trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh.
Từ tháng 3 năm 2006, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học thành phố Hồ Chí
Minh (BV. TMHH TP. HCM) đã áp dụng thường qui các kỹ thuật sinh học phân tử
FISH và RT-PCR trong chẩn đoán, tiên lượng và đặc biệt là theo dõi đáp ứng điều
trị, đánh giá bệnh tồn lưu ở mức độ phân tử ở bệnh lý bệnh BCMDT, BCCDT và
BCCDL. Trong năm 2006, 123 bệnh nhân bệnh bạch cầu được phân tích bằng kỹ
thuật FISH để phát hiện các chuyển đoạn t(9;22), t(15;17) và t(8;21) và bằng kỹ
thuật RT-PCR để phát hiện các tổ hợp gien BCR/ABL, PML/RARA và AML1/ETO
tại Bệnh viện. Trong 2 năm, từ 2008 đến 2010, Bệnh viện phối hợp với Đại học Y
dược TP. HCM triển khai đề tài cấp Nhà nước chuẩn hóa các kỹ thuật di truyền
phân tử trong bệnh lý huyết học.
Việc ứng dụng sinh học phân tử (kỹ thuật RT-PCR, Multiplex PCR, PCR
định lượng gien) cho kết quả nhanh chóng hơn so với các kỹ thuật di truyền như
nhiễm sắc thể đồ hay FISH, nên đáp ứng kịp thời với nhu cầu chẩn đoán bệnh và
chọn lựa phác đồ thích hợp. Kỹ thuật có độ nhạy cao, nên rất thích hợp để theo dõi
điều trị bệnh và đánh giá nguy cơ tái phát bệnh. Bên cạnh đó, chúng ta có thể phát
hiện nhiều bất thường cùng một lúc, thay vì tốn nhiều thời gian và chi phí cho việc
khảo sát từng bất thường như trong kỹ thuật FISH, nên phân nhóm tiên lượng bệnh
sớm.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát
như sau: "Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gien khảo sát các tổ hợp gien thường gặp
trong bệnh lý bạch cầu cấp, góp phần phân loại nhóm tiên lượng bệnh và theo dõi
điều trị, tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh, từ ngày 01
tháng 10 năm 2009 đến 31 tháng 7 năm 2011". Để đạt được kết quả trên, chúng tôi
cần phải thực hiện các mục tiêu chuyên biệt sau:
1. Xác định tỷ lệ của các tổ hợp gien thường gặp lúc mới chẩn đoán trong
nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng tủy.
2. Xác định tỷ lệ của các tổ hợp gien thường gặp lúc mới chẩn đoán trong
nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.
3. Triển khai kỹ thuật PCR định lượng theo dõi điều trị.