Luận Văn ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot

TÓM TẮT


Virus WSSV ( White spot syndrome virus), thành viên của một họ virus mới tên

là Nimaviridae, là một loại virus nguy hiểm đối với tôm penaeids vì khả năng gây chết

cao và nhanh. Đề tài này được tiến hành nhằm phát triển một quy trình kiểm nghiệm

mới ổn định, chính xác và có độ nhạy cao để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú

Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam. Đó là quy trình hoá mô miễn

dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng. Đại học Gent đã

phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng

(monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên

mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh. Quy trình này được nghiên cứu để thay

đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam.


Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X,

1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử

nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và

không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính

hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X.


Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về

tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30

mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp. So với 2

phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng

tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng. Khác với mô học truyền thống,

IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi

vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết. Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản,

mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC

hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả. Chính vì những ưu điểm nổi bật

đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh

WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ

chính xác.


MỤC LỤC


ĐỀ MỤC TRANG

TRANG TỰA

LỜI CẢM TẠ .iii

TÓM TẮT .iv

ABSTRACT .v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .x

DANH SÁCH CÁC HÌNH .x

DANH SÁCH CÁC BẢNG .xi


1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề . 1

1.2. Nội dung 2

1.3. Mục đích .2

1.4. Yêu cầu .2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3

2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú 3

2.1.1. Phân loại 3

2.1.2. Phân bố 3

2.1.3. Vòng đời .3

2.1.4. Sinh trưởng 4

2.1.5. Dinh dưỡng 4

2.1.6. Môi trường sống 5

2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam .5

2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 6

2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam .6

2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng 9

2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng 9

2.2.2.2. Phân loại và tên gọi . 10

2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố

lý hoá . 11

2.2.2.4. Độc lực 12

2.2.2.5. Hình thái 12

2.2.2.6. Cấu trúc 12

2.2.2.7. Vật chất di truyền 13

2.2.2.8. Đa dạng di truyền 15

2.2.2.9. Vật chủ . 16

2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm . 17

2.2.2.11. Cơ chế truyền lan . 18

2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích . 19

2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh 19

2.3. Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác .20

2.4. Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) 21

2.4.1. Lịch sử phát triển .21


2.4.2. Nguyên lý 22

2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) .22

2.4.4. Kháng thể (antibody) .23

2.4.5. Các phương pháp nhuộm 25

2.4.6. Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động

vật nuôi thủy sản 28

3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 30

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30

3.2. Vật liệu 30

3.2.1. Mẫu xét nghiệm .30

3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC 32

3.2.3. Thiết bị và dụng cụ 32

3.2.4. Hoá chất .32

3.3. Phương pháp .33

3.3.1. Bố trí thí nghiệm .33

3.3.2. Quy trình thực hiện 36

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC .41

4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác

nhau 41

4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác

nhau 44

4.2. Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học

truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và

tính hiệu quả .49

4.2.1. So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR,

Mô học và IHC 49

4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR,

Mô học và IHC 57

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1. Kết luận .59

5.2. Đề nghị 59

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

6.1. Tài liệu tiếng Việt .61

6.2. Tài liệu tiếng Anh .61


PHỤ LỤC .70

Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm

IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm

Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4

nồng độ mAb

Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh

virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên

tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm.

Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh

virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC.