Luận Văn ứng dụng kĩ thuật multiplex – pcr để phát hiện một số gen độc lực của nhóm e. Coli sản sinh độc tố s

1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, thì một số dòng E. coli độc có thể gây bệnh trên người và một số loài động vật.
Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác nhau. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli như: gen ehxA, stx1, stx2, và uid của nhóm STEC (Shiga toxigenic E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC (Enteropathogenic E. coli);
Nhìn chung, E. coli có thể được phân lập dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường ô nhiễm phân. Ngoài ra, E. coli còn có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật này có thể tồn tại và phát triển rất lâu trong môi trường. Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E. coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn hay nguồn nước nếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt. Từ đó, có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, và nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường hợp gây tử vong cho người và gia súc.
Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E. coli trong phân gia súc bình thường hoặc tiêu chảy là cần thiết, góp phần trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật và đánh giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm. Từ đó, có những biện pháp phòng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi. Những tiến bộ của công nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúng ta chẩn đoán chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyền thống (nuôi cấy, phân lập, ). Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò. Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ được ứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán và tầm soát bệnh cho gia súc cũng như cho con người qua con đường thực phẩm.
1.2. Mục tiêu – yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
- Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA và uid của E. coli, đặc biệt là nhóm STEC.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập được E. coli từ phân, thịt trên một số loại môi trường chọn lọc (MAC, SMAC, CT - SMAC).
- Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR phát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được.

MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các bảng x
Danh sách các sơ đồ, biểu đồ, hình xi
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu – yêu cầu 2
1.2.1. Mục tiêu 2
1.2.2. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Vi khuẩn E. coli 3
2.1.1 Đặc điểm sinh học 3
2.1.2. Yếu tố kháng nguyên 3
2.1.3. Phân loại E. coli 4
2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC) 5
2.2.1.Thuật ngữ 5
2.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 6
2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx) 6
2.2.2.2. Enterohemolysin 8
2.2.2.3. Yếu tố bám dính 8
2.2.3. Cách sinh bệnh 9
2.2.4. Khía cạnh lâm sàng 10
2.2.5. Dịch tễ học 11
2.2.6. Chẩn đoán 12
2.2.7. Phòng ngừa 12

2.3. Serotype O157:H7 12
2.4. Kỹ thuật PCR 14
2.4.1. Khái niệm 14
2.4.2. Nguyên tắc 14
2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR 15
2.4.4. Phân tích kết quả PCR 16
2.4.5 Multiplex – PCR 16
2.4.6. Ứng dụng 16
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 18
3.1.1. Thời gian 18
3.1.2. Địa điểm 18
3.2. Nội dung thực hiện 18
3.3. Phương pháp thực hiện 18
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản . 18
3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 19
3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli 19
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy 19
3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính 19
(1) Nuôi cấy và phân lập 19
(2) Chọn khuẩn lạc E. coli 20
(3) Thử sinh hóa 20
3.3.3. Ly trích DNA 20
3.3.4. Qui trình multiplex – PCR 22
3.3.5. Điện di, đọc kết quả 23
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 24
4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảy 26
4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 28
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ bề mặt thịt bò 29
4.5 Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò và heo 31
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34
5.1. Kết luận 34
5.2. Tồn tại và đề nghị 34
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
7. PHỤ LỤC 41

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A/E Attaching-and-effacing
CT - SMAC Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
Eae E. coli attaching and effacing
FAO Food and Agriculture Organization
FDA Food and Drug Administration
HC Haemorrhagic colitis
HCT Khuẩn lạc hồng trên môi trường CT - SMAC
EhxA Haemolysin
HM Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC
HS Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC
HUS Haemolytic uraemic syndrome
IMViC Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon Citrate
MAC MacConkey
NA Nutrient agar
PCR Polymerase chain reaction
PVC Môi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefixime
SMAC Sorbitol MacConkey
STEC Shiga toxin-producing E. coli
Stx Shiga toxin
TBE Tris borate EDTA
TCT Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT - SMAC
TS Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC
UV Ultra violet