Luận Văn ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16s rRNA trên dna ty thể trong định danh cá bột thuộc họ P

TÓM TẮT
​

Khóa phân loại hình thái đóng một vai trò quan trọng trong việc định danh cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae vốn có ý nghĩa về kinh tế đối với vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, phương pháp này cho độ chính xác nhất định. Vì vậy chúng tôi phân tích sự khác nhau ở mức độ di truyền cụ thể là vùng 16S rRNA (xấp xỉ 568 bp) trên DNA ty thể (mt DNA) ở 3 loài (đã có sẵn dữ liệu trên ngân hàng gene) để hỗ trợ phương pháp định danh hình thái. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phân loại bằng hình thái 976 mẫu cá thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Kết quả họ Pangasiidae chiếm 36,56% so với tổng mẫu thu được năm 2006; 3 loài phân tích (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm 33,63% so với tổng mẫu Pangasiidae thu được nhưng số lượng chỉ chiếm 11,36% so với tổng lượng cá thể họ Pangasidae. Các mẫu cá năm 2006 sau khi khi phân tích hình thái không phân tích được DNA (do DNA bị hủy trong formal), 26 cá thể từ 64 mẫu cá bột thu từ 22/6/2007 đến tháng 30/6/2007 được bổ sung của 3 loài nêu trên với kích thước khác nhau (từ 15 mm – 30 mm), giải trình tự và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng genbank để kiểm tra lại độ tin cậy của phương pháp phân tích hình thái. Kết quả đạt được như sau:
 Trình tự 8/9 mẫu loài P. hypophthalmus tương đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P. hypophthalmus trên ngân hàng gene (DQ334282, DQ334285, DQ334287). Riêng mẫu H1 có một đột biến thay thế nucleotide ở vị trí thứ 26 so với tám kiểu gene tham khảo trên ngân hàng gene.
 Trình tự 9 mẫu phân tích loài P. macronema giống từ 99% - 100% trình tự P. macronema trên ngân hàng gene (DQ334314).
 Trình tự 8 mẫu loài P. larnaudii tương đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P. larnaudii trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312; DQ334313).
Tóm lại, qua kết quả so sánh trình tự của 26 mẫu thuộc 3 loài phân tích với trình tự dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene đã khẳng định được khoá phân loại hình thái đối với các loài mà chúng tôi đưa ra là phù hợp.
MỤC LỤC
ĐỀ MỤC TRANG
Lời cảm tạ III
Abstract IV
Tóm tắt . V
Mục lục . VI
Danh sách các chữ viết tắt IX
Danh sách các hình . X
Danh sách các bảng và biểu đồ XI
Chương 1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
1.3. Nội dung đề tài . 2
Chương 2. TỔNG QUAN . 3
2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá . 3
2.1.1. Nghiên cứu thế giới . 3
2.1.2. Nghiên cứu trong nước 4
2.2. Phương pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae 5
2.3. Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá 8
2.3.1. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) . 8
2.3.2. Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 8
2.3.3. Phương pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 8
2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) 9
2.3.5. Phương pháp PCR 11
2.3.6. Phương pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động 12
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 13
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện . 13
3.2. Vật liệu . 13
3.2.1. Mẫu cá 13
3.2.2. Hóa chất . 13
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ 14
3.3. Phương pháp . 15
3.3.1. Phương pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột 15
3.3.2. Phương pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform 16
3.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA 16
3.3.4. Phương pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose 17
3.3.5. Phương pháp giải trình tự 18
3.3.6. Phương pháp so sánh các trình tự 18
3.4. Bố trí thí nghiệm . 18
3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae . 18
3.4.1.1. Giai đoạn định tính 18
3.4.1.2. Giai đoạn định lượng 20
3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA . 21
3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 22
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae . 23
4.1.1. Kết quả hình thái phân loại 23
4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính 25
viii
4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu được năm 2006 25
4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu Pangasiidae 27
4.1.3. Kết quả giai đoạn định lượng 29
4.1.3.1. Tỉ lệ số lượng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác 29
4.1.2.4. Tỉ lệ số lượng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lượng cá thể họ Pangasiidae . 31
4.2. Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA . 33
4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA . 34
4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA . 34
4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá 38
4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema 38
4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus 40
4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. . 42
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Tồn tại . 45
5.3. Đề xuất 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 46
PHỤ LỤC 50