Luận Văn Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ P

MỤC LỤC


ĐỀ MỤC TRANG


Lời cảm tạ III


Abstract IV


Tóm tắt .V


Mục lục . VI


Danh sách các chữ viết tắt IX


Danh sách các hình .X


Danh sách các bảng và biểu đồ XI


Chương 1. MỞ ĐẦU .1


1.1. Đặt vấn đề .1


1.2. Mục tiêu đề tài 2


1.3. Nội dung đề tài .2


Chương 2. TỔNG QUAN .3


2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá .3


2.1.1. Nghiên cứu thế giới .3


2.1.2. Nghiên cứu trong nước 4


2.2. Phương pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc


họ Pangasiidae 5


2.3. Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá 8


2.3.1. Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .8


2.3.2. Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 8


2.3.3. Phương pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 8


2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) 9


2.3.5. Phương pháp PCR 11


2.3.6. Phương pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động 12


Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP .13


3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .13


3.2. Vật liệu .13


3.2.1. Mẫu cá 13


3.2.2. Hóa chất .13


3.2.4. Thiết bị và dụng cụ 14


3.3. Phương pháp .15


3.3.1. Phương pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột 15


3.3.2. Phương pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform 16


3.3.3. Phương pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA 16


3.3.4. Phương pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose 17


3.3.5. Phương pháp giải trình tự 18


3.3.6. Phương pháp so sánh các trình tự 18


3.4. Bố trí thí nghiệm .18


3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae


.18


3.4.1.1. Giai đoạn định tính 18


3.4.1.2. Giai đoạn định lượng 20


3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA .21


3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 22


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23


4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ


Pangasiidae .23


4.1.1. Kết quả hình thái phân loại 23


4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính 25


4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu được


năm 2006 25


4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu


Pangasiidae 27


4.1.3. Kết quả giai đoạn định lượng 29


4.1.3.1. Tỉ lệ số lượng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác 29


4.1.2.4. Tỉ lệ số lượng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lượng cá


thể họ Pangasiidae .31


4.2. Ghi nhận các điểm đặc trưng của cá bột trước khi phân tích DNA .33


4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA .34


4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA .34


4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá 38


4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema 38


4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus 40


4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii 42


Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .44


5.1. Kết luận 44


5.2. Tồn tại .45


5.3. Đề xuất 45


TÀI LIỆU THAM KHẢO .46


PHỤ LỤC 50


DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG


Hình 2.1.Pangasianodon hypophthalmus Sauvage (1878), 15 mm .6


Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 16 mm. 6


Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm. 7


Hình 2.4: H.2.5a. Cấu tạo tổng quát của ty thể. 9


Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan .12


Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm 33


Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm .34


Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm .34


Hình 4.4. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu


năm 2006 và năm 2005 .35


Hình 4.5: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá


đại diện 38


Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu


cá P. macronema .39


Hình 4.7: Sự tương đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P.


hypophthalmus 41


Hình 4.8: Sự tương đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P.


larnaudii .43


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ


BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG


Bảng 2.1. Số lượng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart


Termvidchakorn,2003) 7


Bảng 4.1. Kích thước các mẫu cá phân tích 37


Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ họ Pangasiidae thu được trên tổng mẫu thu năm 2006 .25


Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lượng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae .25


Biểu đồ 4.3. Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu


được .27


Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lượng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lượng mẫu


Pangasiidae 27


Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lượng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác .29


Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lượng các loài nghiên cứu so với tổng lượng


Pangasiidae .29


Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lượng cá thể họ


Pangasiidae .31


Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lượng từng loài nghiên cứu so với tổng lượng


Pangasiidae .31


xi