Tiến Sĩ Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về cây lily . 3
1.1.1. Giới thiệu chung về lily 3
1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily . 3
1.1.3. Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily . 4
1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của
cây lily 5
1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật . 6
1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 6
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily . 8
1.2.3. Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily 9
1.3. Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở
thực vật 15
1.3.1. Giới thiệu chung về glycine betaine 15
1.3.2. Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng . 16
1.4. Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công
nghệ gen . 17
1.4.1. Công nghệ tế bào trong tạo giống lily 17
1.4.2. Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily 18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 21
2.1. Vật liệu 21
2.1.1. Thực vật . 21
2.1.2. Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng 22
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 24
2.1.4. Máy móc và thiết bị . 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 25
2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu 25
2.2.2. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và
cứu phôi 27
2.2.3. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng kỹ
thuật gen . 30
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37
3.1. Đánh giá tập đoàn các giống lily nghiên cứu . 37
3.1.1. Đánh giá quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu bằng chỉ thị
phân tử 37
3.1.2. Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của một số giống lily nghiên cứu 39
3.1.3. Ngưỡng chịu nóng in vitro của một số giống lily nghiên cứu . 41
3.2. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi 44
3.2.1. Kiểm tra chất lượng hạt phấn của một số giống hoa lily nghiên cứu 44
3.2.2. Lai tạo và cứu phôi . 45
3.2.3. Bước đầu xác định con lai bằng chỉ thị phân tử . 48
3.4.4. Khả năng chịu nhiệt cao của mô vảy củ của các dòng lily lai được
tạo ra . 53
3.3. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng công nghệ gen . 55
3.3.1. Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase 55
3.3.2. Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily bằng
A. tumefaciens . 62
3.3.3. Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily . 71
3.3.4. Khả năng chịu nóng các dòng lily chuyển gen 73
3.3.5. Khả năng tích lũy glycine betaine ở một số dòng lily chuyển gen codA . 77
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 91
1. Kết luận 91
2. Đề nghị 92
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ . 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO 95
SUMMARY . 112
PHỤ LỤC . 115
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu
thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng.
Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa
đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ,
hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở
nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở
những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao. Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu
toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây
trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí
khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này. Nước ta nằm trong
khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử
nghiệm một số giống lily vụ đông. Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên
toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp
nhiều trở ngại. Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao,
thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất
lượng cây hoa thấp. Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và
chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ
cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010).
Với nhiều phương pháp hiện đại đang được áp dụng, nhiều giống cây trồng
nói chung, cây hoa nói riêng hiện nay đang được phát triển một cách chủ động.



Trong chọn tạo giống hoa lily, lai xa là một phương pháp truyền thống đang được
kết hợp với một số kỹ thuật hiện đại có thể tạo giống mới đạt được nhiều mục đích
khác nhau thông qua việc tái tổ hợp vật chất di truyền của các dòng bố mẹ (VanTuyl
et al., 1991,2003; Chi, 2002). Bên cạnh đó, giống hoa lily cũng ngày càng được làm
phong phú hơn nhờ tiến hành kỹ thuật chuyển gen. Gen codA mã hóa choline
oxidase, tham gia sinh tổng hợp glycin betaine đã được chuyển thành công vào
nhiều loài cây trồng và được chứng minh là cây chuyển gen ít nhiều có khả năng chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi. Ví dụ như cây Arabidopsis thaliana
chuyển gen codA đã được tăng cường khả năng chịu nóng, lạnh và băng giá (Alia et
al., 1998; Sakamoto et al., 2000), cây cải bẹ, bạch đàn, cà chua chuyển gen codA
cũng tăng cường khả năng chịu mặn và oxy hóa (Prasad et al., 2000a; Ahma et al.,
2008; Yu et al., 2009). Ở cây lily, việc chuyển một gen nhằm tăng cường khả năng
chịu nóng chưa được thực hiện từ trước đến nay. Chính vì vậy, việc chuyển gen
codA vào lily nhằm tăng cường khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi,
đặc biệt là nhiệt độ cao là điều cần thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công
nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả
năng chịu nóng” làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng
chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường.
Đề tài được thực hiện với các nội dung gồm:
(i) Đánh giá nguồn gen lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử và công nghệ
nuôi cấy mô tế bào; (ii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng lai tạo và
cứu phôi; (iii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng xây dựng và tối ưu
hóa quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua A. tumefaciens; (iv) Chọn
dòng lily in vitro có khả năng chịu nóng.
Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao
gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn
tạo các dòng hoa Lilium spp. có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao
với mục tiêu cụ thể là (1) xây dựng được quy trình chuyển gen codA vào lát cát
vảy củ lily, (2) ứng dụng kỹ thuật lai và nuôi cấy mô phôi tạo con lai chi lily và
(3) đánh giá khả năng chịu nóng in vitro của các dòng lily thương mại, dòng lily
chuyển gen và dòng con lai.
Những kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở lý luận và thực tiễn cho
việc ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong tạo giống cây trồng mới nói
chung và cây lily nói riêng có khả năng chống chịu điều kiện nhiệt độ cao.