Thạc Sĩ Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sative L.)

Luận án tiến sĩ năm 2012
Đề tài: Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sative L.)


MỤC LỤC Trang
Trang phụbìa i
Lời cam đoan ii
Lời cảm tạ iii
Mục lục v
Danh sách bảng viii
Danh sách hình x
Danh mục các từviết tắt xiv
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đềtài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
3.1. Ý nghĩa khoa học 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
CỦA ĐỀ TÀI
4
1.1Cơ sở khoa học của đề tài 4
1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơmvà một sốyếu tốmôi
trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa
4
1.1.2 Nguyên lý và yêu cầu trong chọn giống bằng MAS 9
1.1.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn BAC (Bacterial
Artificial Chromosome)
9
1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền 15
1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa 15
1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR
trong chọn lọc gen mùi thơm
19
1.2.3Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng BAC
DNA trong chọn giống lúa
25
vi
Chương 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
28
2.1 Địa điểm nghiên cứu 28
2.2 Thời gian thực hiện 28
2.3 Vật liệu nghiên cứu 28
2.4 Nội dung nghiên cứu 29
2.5 Phương pháp nghiên cứu 29
2.5.1Phương pháp lai tạo 29
2.5.2 Phương pháp phòng thí nghiệm 33
2.6 Phân tích thống kê và xửlý sốliệu 46
Chương 3: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 47
3.1 Khảo sát đặc tính thơm và không thơm trên các giống lúa mùa
và lúa cao sản
47
3.1.1Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa mùa địa phương 47
3.1.2 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm bằng chỉthịSSR
trên các giống lúa mùa
65
3.1.3 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa cao sản 68
3.1.4 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm trên các giống lúa
cao sản thửnghiệm
72
3.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên các giống sửdụng
làm vật liệu lai và quần thểcon lai sau khi được lai tạo
76
3.2.1Đánh giá mùi thơm trên các giống lúa bốmẹ 76
3.2.2Phát triển quần thểcủa20tổhợp lai 78
3.2.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình của các
giống lúa bốmẹ và các tổhợp lai thếhệF1
79
3.2.4Phân tích sự biểu hiệndi truyềnmùi thơm ở quần thể cây
lai F1
82
3.2.5Phân tích sựbiểu hiện di truyền mùi thơm ở quần thểF3
từcặplai OM2517/OM3536
83
vii
3.2.6Đánh giá kiểu gen mùi thơm của một sốgiống bốmẹvà tổ
hợp lai bằng chỉthịphân tử
84
3.2.7 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên quần thể
BC2F2 từtổhợp lai OM2517/OM3536
86
3.3 Khai thác thư viện BAC nhằm dòng hóa vùng chứa gen qui định
mùi thơm
92
3.3.1Sàng lọc gen thơm của cây lúa thông qua BAC DNA 92
3.3.2 Xây dựng BAC contig (các chuỗi DNA nhân bản nằm liền
kề) trên vùng gen mùi thơm
104
3.3.3 Xác định BAC DNA chứa alen mùi thơm 105
3.3.4 Ứng dụng chỉthịphân tửtrong chọn lọc dòng mang gen
mùi thơm
106
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 112
4.1 Kết luận 112
4.2 Đềnghị 113
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi
sống hơn 50 % dân số thế giới[62]. Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu
thốn, lương thực không đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu là ăn no. Nhưng ngày nay do
mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì nhu cầu ăn no đã thay đổi, việc ăn
ngon, có dinhdưỡng cao dần dần trở thành nhu cầu quan trọng không thể thiếu đối
với con người. Mặt khác, ngày nay nước ta đã qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển
sang thời kỳ sản xuất phải có lờivà đang xuất hiện những mô hình sản xuất vừa có
lời, vừa bền vững trong môi trường sinh thái trong lành. Một trong những mô hình
này là làm lúa thơm đặc sản, do đó chất lượng gạo được xem như là một trong
những mục tiêu hàng đầu, trong đó mùi thơm được đánh giá rất cao trên thị trường
xuất khẩu gạo của thế giới. Sản lượng gạo thơm từ các giống lúa thơm cổ truyền
như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk
Mali, Basmati, . thì có rất ít không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và khó mở rộng
diện tích. Do đó các nhà chọn giống đã liên tục nghiên cứu và lai tạo ra những
giống lúa mới có chất lượngcao và giữ được mùi thơm đặc trưng của giống.
Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học đã
ứng dụng những kỹ thuật trong sinh học phân tửnhưtái tổ hợp DNA, giải mã chuỗi
trình tự gen. Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC -Bacterial Artificial Chromosome) như là một công cụ có sức thuyếtphục mạnh mẽ
nhất để xây dựng thư viện bộ gen cho cây lúa, thành lập bản đồ vật lý có chất lượng
cao và dùng để hợp nhất bản đồ vật lý với bản đồ di truyền. Bên cạnh đó, việc sử
dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC đểxác địnhgen mùi thơm trên cây lúacũng
là một trong những ứng dụng từ thư viện BAC.
Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: ”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và
dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)”được thực
hiện.
2
2.Mục tiêu nghiên cứu
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr”
trên các dònggiốnglàm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dòng con
lai có chứa gen mùi thơm.
-Khai thác thư viện BAC để hổ trợ tìm kiếm những chỉ thị liên kết với tính
trạng mùi thơm trên cây lúa.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
-Xác định những dấu chuẩn phântử riêng biệtliên kết với gen“fgr”trên cây
lúagiúp cho việc chọn dòng con lai hiệu quả hơn.
-Xác định những dòng BAC DNA để tạo các chỉ thị mới liên kết với gen qui
định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BACđể hiểu rõ hơn về kỹ thuật dòng hóa
gen mục tiêu, phục vụ nghiên cứu sâu hơn về chức năng gen này.
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Đề tài đã góp phần bổ sung những dòng lúacó triển vọng biểu thị mùi thơm
thông qua ứng dụng những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt vớigen “fgr”
phục vụ cho việc phát triển những giống lúa thơmcao sản ở ĐBSCL.
- Với những kết quả đạt đượctừ việc khai thác thư viện BAC, đềtài đã tìm
và phân tích chỉthị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ
cho chọn giống lúa.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
-Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao
sản hiện đang được duy trì và nhân giống.
- Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi
thơm.
-Phạm vi nghiên cứu:
+ Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên kết
với gen “fgr”trên nhiễm sắc thể số 8 và ứng dụng kết quảtrên để chọn giống lúa
cao sản có gen mục tiêu.
3
+ Phân lập được đoạn phân tử mang gen mục tiêu.
+ Chưa phân tíchphổ chức năng (gene profile).
+ Chưa nghiên cứu được điều kiện để gen thể hiện (gene expression)
ở các qui mô khác nhau.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu (2006), “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa năng suất cao, phẩm chất
tốt phục vụ xuất khẩu 2003-2005”, Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng
Nông Lâm Nghiệp và giống vật nuôi, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long.
2. Bùi Chí Bửu vàNguyễn Thị Lang (1999), Di truyền phân tử: Những nguyên tắc
cơ bản trong chọn giống cây trồng, Quyển I, Nxb Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí
Minh, tr.278.
3. Bùi Chí Bửu vàNguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, Nxb Nông Nghiệp,
Tp.Hồ Chí Minh, tr.151-153.
4. Bùi Chí Bửu vàNguyễn Thị Lang (2007), Hội thảo khoa học kỷ niệm 30 năm
thành lập Viện, Bộ NN&PTNT, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, Cờ
Đỏ.
5. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB giáo dục.
6. Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Quốc Lý, Đào Quang Hưng và Lê Thanh Tùng
(2006), Giống và thời vụ sản xuất ở đồng bằng sông Cửu Long, Nxb Nông
Nghiệp -TP.Hồ Chí Minh.
7. Bùi Thị Dương Khuyều (2004), Ứng dụng đánh dấu vi vệ tinh (microsatellite
marker) trong chọn giống lúa (Oryza sativa L.)có mùi thơm, Luận án thạc
sĩ CNSH, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinhhọc, trường đại học
Cần Thơ.
8. Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh
học, Nxb Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Thị Lang (2005), Nghiên cứu và phát triển một số giống lúa đặc sản cho
một số vùng sinh thái của ĐBSCL 2001-2005, Cần Thơ.
10. Nguyễn Thị Lang vàBùi Chí Bửu (2002), “Chọn giống lúa có gen kháng bệnh
đạo ôn nhờ marker phân tử”, Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây
trồng,Nxb Nông Nghiệp,Tp.Hồ Chí Minh, tr.183-195.
11. Nguyễn Thị Lang vàBùi Chí Bửu (2004), “Nghiên cứu di truyền cho gen kháng
mặn trên quần thể trồng dồn của cây lúa”, Tạp chí NN&PTNT, (6), tr.824-826.
12. Nguyễn Thị Lang vàBùi Chí Bửu (2005), Sinh học phân tử:Giới thiệu và Ứng
dụng, NXB NôngNghiệp, Tp.Hồ Chí Minh.
13. Nguyễn Thị Lang, Bùi chí Bửu, Đặng Minh Tâm, Trịnh Hòang Khải, Bùi Thị
Dương Khuyều, Nguyễn Hữu Nghị, Trần Ngọc Ân và Nguyễn Trúc
Phương (2005), Ứng dụng CNSH trong chọn giống lúa chất lượng cao
phục vụ cho tỉnh Tiền Giang 2003-2005, Sở KH-CN tỉnh Tiền Giang.
14. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thúy Kiều Tiên, Bùi Thị Dương
Khuyều, Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Văn Việt, LâmTấn Tài, Thạch Sơn và
Nguyễn Thị Ngọc Hà (2006), Xây dựng phát triển mạng lưới nhân giống
lúa và cung cấp giống lúa thơm tác giả cho tỉnh Trà Vinh 2004-2006, Đề
tài cấp tỉnh, Trà Vinh.
15. Nguyễn Thị Lang, Bùi Thị Dương Khuyều, Nguyễn Tiến Huyền, Vũ Hiếu Đông
vàBùi Chí Bửu (2005), “Đánh giá tài nguyên ditruyền của lúa đặc sản địa
phương vùng ĐBSCL bằng marker vi vệ tinh (microsatellite)”, Tạp chí
NN&PTNT, (17), tr.15-18-22.
16. Nguyễn Thị Lang, Nguyễn Thị Tâm, Trịnh Thị Lũy, Đặng Minh Tâm vàBùi
Chí Bửu (2004), “Nghiên cứu chọn giống lúa phẩm chất cao phục vụ cho
ĐBSCL”, Báo cáo khoa học hội nghị quốc gia chọn tạo giống lúa, Cần
Thơ.
17. Nguyễn Thị Lang và Nguyễn Thúy Liễu (2006), “Ứng dụng marker phân tử
nghiên cứu gen mùi thơm trên lúa Nàng Thơm Chợ Đào và bộ giống lúa
cao sản ngắn ngày tại ĐBSCL”, Tạp chí NN&PTNT,(11), tr.12-17.
18. Nguyễn Thị Lang, Trương Bá ThảovàBùi Chí Bửu (2004), “Nghiên cứu di
truyền trên gen thơm cây lúa”, Tạp chí NN&PTNT, (6), tr.827-829.