Luận Văn Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh enzyme phytase


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG .v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT . vii
MỞ ĐẦU .1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. Phytase 3
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Phân loại .3
1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động .3
1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase 4
1.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase .5
1.1.3.1. Nguồn vi sinh vật .5
1.1.3.2. Nguồn thực vật .6
1.1.3.3. Nguồn động vật 6
1.1.4. Cơ chất đặc hiệu của phyase 8
1.1.4.1. Acid phytic và phytat .8
1.1.4.2. Các cơ chất khác 9
1.1.5. Các đặc tính lý hóa của phytase .10
1.1.5.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử 10
1.1.5.2. Nhiệt độ 10
1.1.5.3. pH .11
1.1.5.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số chất hóa học lên hoạt
độ phytase .11
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổnghợp phytase ở vi sinh vật 12
1.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase .13
iii
1.1.7.1. Ứng dụng phytase trong sản xuât thức ăn gia súc, gia cầm .13
1.1.7.2. Ứng dụng phytase trong sản xuất thực phẩm .14
1.1.7.3. Ứng dụng phytase trong sản xuât myo-inositol phosphat 14
1.1.7.4. Ứng dụng phytase trong sản xuất bột giấy và công nghiệp giấy .15
1.2. Đại cương về Bacillussinh enzyme phytase 15
1.2.1. Vài nét về Bacillus .15
1.2.2. Phân loại phytase của Bacillus .16
1.2.3. Cơ chất đặc hiệu .17
1.3.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuấtở Việt Nam 17
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18
2.1. Đối tượng và vật liệu 18
2.1.1. Đối tượng 18
2.1.2. Vật liệu .18
2.1.2.1. Hóa chất .18
2.1.2.2. Thuốc nhuộm .18
2.1.2.3. Thiết bị .18
2.1.3. Môi trường nuôi cấy .19
2.1.3.1. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy 19
2.1.3.2. Môi trường tăng sinh: môi trường BHB (g/l) 19
2.1.3.3. Môi trường nuôi cấy xác định khả năng sinhphytase .19
2.3.3.4. Môi trường để xác định các yếu tố ảnh hưởng (Nhiệt độ, pH,
thời gian) .19
2.1.3.5. Cách chuẩn bị môi trường 20
2.2. Các phương pháp nghiên cứu .20
2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillustừ Natto 20
2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh phytase .20
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ phytase 21
2.2.3.1. Phương pháp định lượng phosphate (phương pháp Fiske và
Subbarow) .21
iv
2.2.3.2. Cách tính hoạt độ enzyme phytase .24
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase
sinh ra .24
2.2.5. Khảo sát các ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân
hytate của enzyme phytase .25
2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase .25
2.2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase .26
2.2.6. Sơ bộ đánh khả năng sinh enzyme phytase của vi khuẩn phân lập
được trên bã sắn 27
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Phân lập chủng Bacillus 28
3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc .28
3.3. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 29
3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme phytase của các chủng Bacillus 31
3.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của Bacillustrên môi trường lỏng .32
3.5.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng phospho .33
3.5.2. Khảo sát hoạt độ phytase của chủng Bacillustrên môi trường lỏng 34
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến enzyme phytase
sinh ra .35
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng thủy phân phytate
của enzyme phytase .36
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase .36
3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ phytase .37
3.7. Kết quả đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân của enzyme phytase của vi
khuẩn ở trên bã sắn 38
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .40
PHỤ LỤC
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại một số phytase 5
Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase 7
Bảng 1.3: Hàm lượng phytat và phospho trong các sảnphẩm cây trồng .9
Bảng 2.1: Bảng dung dịch đường chuẩn .23
Bảng 2.2: Bảng xác định lượng phosphat trong dịch enzyme 23
Bảng 3.1: Đo đường kính của vòng phân giải của enzyme trong môi trường thạch 32
Bảng 3.2: Tương quan giữa giá trị ∆OD với hàm lượngphospho giá trị
∆OD
700
với hàm lượng phospho 33
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase 3
Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase 4
Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase 4
Hình 1.4: Cấu trúc acid phytic 8
Hình 2.1: Sơ đồ của quá trình phân lập vi khuẩn Bacillustừ Natto .20
Hình 2.2: Sơ đồ xác định khả năng sinh enzyme phytase .21
Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến enzyme phytase 24
Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đếnhoạt độ phytase .25
Hình 2.5: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase 26
Hình 3.1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bacillus .28
Hình 3.2: Các chủng Bacillus phân lập được 29
Hình 3.3: Hình thái tế bào của chủng Bacillus .30
Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng Bacillus(có sinh bào tử) .30
Hình 3.5: 3 chủng vi khuẩn không xuất hiện vòng phân giải .31
Hình 3.6: Hoạt tính phân giải enzyme phytase của 3 chủng Bacillus .32
Hình 3.7: Đường biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ phospho và
giá trị ∆OD
700
33
Hình 3.8: Hoạt độ chung của phytase của 3 chủng Bacillusnuôi cấy trong môi
trường lỏng, cơ chất cảm ứng là sodium phytase 34
Hình 3.9: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo thời gian nuôi cấy 35
Hình 3.10: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo nhiệt độ nuôi cấy .36
Hình 3.11: Đường biến thiên hoạt độ phytase của B7 theo pH nuôi cấy 37
vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
HAPs : Histidin acid phosphat
BPP : β-propeller phytase
PAP : acid phosphatase
Ins : Inositol
OD : Độ hấp thụ của dung dịch (giá trị mật độ quang)
ODo
: Giá trị mật độ quang của ống thử không
ODt
: Giá trị mật độ quanh của ống thử thật
∆OD : Hiệu số mật độ quang (∆OD = OD
t– OD
o
)
đvhđ : Đơn vị hoạt độ
TB : Trung bình
1
MỞ ĐẦU
Vi sinh vật trong tự nhiên rất là phong phú và đa dạng. Chúng ở khắp mọi
nơi xung quanh ta như: trong đất, trong nước, trongkhông khí thậm chí có cả trong
cơ thể của con người. Chúng có thể gây ra cho ta những bất lợi như bệnh lao, bệnh
dịch hạch, bệnh tả, đại dịch cúm ở con người và cả gia cầm, Nhưng vi khuẩn
cũng đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết
cách sử dụng chúng vào mục đích có lợi sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn.
Từ xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật
phục vụ cho đời sống của mình như là tạo ra các loại rượu nhờ quá trình lên men
của vi sinh vật, tạo ra các loại thức ăn từ quá trình lên men như đậu tương lên men
(natto) của Nhật, tạo ra loại nước giải khát lên men, các chế phẩm enzyme lấy từ vi
sinh vật phục vụ cho trồng trọt, chăn nuôi.
Ngày nay khi chúng ta đang sống ở thế kỷ XXI, thế kỷ của khoa học và kỹ
thuật ngày càng phát triển thì công nghệ vi sinh càng ngày càng chứng tỏ được ưu
thế của mình
Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh họckhác nhau đã được tổng
hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho
nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và cả đời sống của con người.
Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus đã và đang được sử
dụng trong chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: bia, rượu, y
học, công nghiệp dệt, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy
sản, phân hủy thức ăn của vật nuôi
Xuất phát từ thực tiễn đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi
khuẩn Bacillussinh enzyme phytase” với các nội dung sau:
1. Tuyển lựa vi khuẩn Bacillusmẫu thực phẩm lên men (Natto) để chọn các
chủng Bacillus ở các mẫu khác nhau
2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số
đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chon.
2
3. Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năngthủy phân của enzyme
thu được.
4. Sơ bộ đánh giá khả năng thủy phân của enzyme thunhận được trên bã sắn.
Để tài này được thực hiện tại phòng Vi sinh vật củaKhoa công nghệ thực
phẩm thuộc trường Đại học Nha Trang.
3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phytase
1.1.1. Định nghĩa [6][17]
Phytase (myo-inositol hexakisphosphat phosphohydrolase) là enzyme xúc tác
cho phản ứng thủy giải liên kết monophosphoester của acid phytic hoặc muối
phytat, giải phóng orthophosphat và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm
phosphat hơn hay các myo-inositol tự do.
Phản ứng có thể khái quát như sau:
myo-inositol hexakisphosphat +H2O
D-myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphat + phosphat
Hình 1.1: Phản ứng thủy giải phytase bởi enzyme phytase
1.1.2. Phân loại [6][17]
1.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phospho đầu tiên bị tác động
Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of
Biochemistry and Molecular Biology), IUPAC-IUB, JCBN (Joint Commission on
Biochemical Nomenclature) đã chia phytase thành 2 loại:
EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là myo-inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết
ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins-1,2,4,5,6-pentakisphosphat và orthophosphat. Đây làdạng thường gặp đối với các
phytase có nguồn gốc vi sinh vật.
4
Myo-inositol
hexakisphosphat
+ H(2)O =
1D-myo-inositol1,2,4,5,6-
pentakisphosphat
+
phosphat
Hình 1.2: Phản ứng thủy giải 3-phytase
EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên hệ thống là myo-inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên kết
ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphat và orthophosphat. 6-phytase là dạng thường gặp đối với
phytase có nguồn gốc thực vật.
Myo-inositol
hexakisphosphat
+ H(2)O =
1D-myo-inositol1,2,3,5,6-
pentakisphosphat
+
phosphat
Hình 1.3: Phản ứng thủy giải 6-phytase
1.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase
Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm thông
tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney, Ullah, đã phân chia
phytase thành 3 nhóm.
Nhóm thứ 1(EC3.1.3.2): Bao gồm các acid phosphatase hoặc histidin acid
phosphat (HAPs). Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và quá
trình thủy giải phosphomonoester gồm các bước giốngnhau.
5
Nhóm thứ 2(EC3.1.3.8): Là các β-propeller phytase (BPP), chủyếu là các
enzyme của Bacillis. Cho đến nay việc phân lập, xác định các gen điều khiển hoạt
động của phytase thuộc nhóm này chưa đầy đủ. Các nghiên cứu cho thấy, hiện có 2
loại phytase của Bacillus đã được xác định, đó là phyC do Kerovuo và các cộngsự
phát hiện vào năm 1998 và TS-phy do Kim và các cộngsự phát hiện vào năm 1998.
Nhóm thứ 3(EC3.1.3.2): Bao gồm các purple acid phosphatase (PAP).
Gmphy được chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzyme này.
Người ta đã xác định được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế xúc tác của
Gmphy.
Bảng 1.1: Phân loại một số phytase [12]


TÀI LIỆU THAM KHẢO
 Tài liệu tiếng việt
[1]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyễn, Phạm Văn Ty (2000), “Vi sinh vật
học”, Nhà xuất bản giáo dục.
[2]. Nguyễn Lân Dũng (1983), “Thực hành vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại học
và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội
[3]. Nguyễn Duy Khánh (2006), “Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi
khuẩn Bacillus subtilis”, Luận văn kỹ sư, Trường đại học Nông lâm Thành phố Hồ
Chí Minh.
[4]. Nguyễn Thị Phương Như (2009), “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”, Đồ án tốt nghiệp, Trường đại
học Nha Trang.
[5]. Lương Đức Phẩm, “Công nghệ vi sinh vật”, Nhà xuất bản Nông nghiệp
[6]. Lê Quốc Phong (2007), “Nghiên cứu một số đặc tính và bước đầu thử nghiệm
ứng dụng enzyme phytase của Bacillus spp.”, Luận văn thạc sĩ, Trường đại học
Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
[7]. Bùi Thị Phi (2007), “Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả
năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm
sinh học”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
[8]. Nguyễn Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Hải (2011), “Thực hành vi sinh vật thực
phẩm”, Khoa Công Nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Nha Trang.
 Tài liệu tiếng Anh
[9]. Afr. J. Biotechnol (2008), “Review Improvement in the nutritive quality of
cassava and its by-products through microbial fermentation”, Department of
Animal Production and Health, Federal University ofTechnology.
[10]. Alex Oderkirk (1998), “Phytase enzyme for Layers Poultry Fact sheet”,
Poultry Specialist, Nova Scotia Department of Agriculture and Marketing.
41
[11]. Janne Kerovo (2000), “A novel phytase from Bacillus, characterization and
production of the enzyme”, Finland, Helsinky.
[12]. Tye A.J, Siu F.K.Y, Leung T.Y.C and Lim B.L (2002), “Molecular cloning
and the biochemical characterization of two novel phytase from B.subtilis 168 and
B. licheniformis”, Applied and Enviromental Microbiology.
[13]. Young-OK Kim, Huyng-Kwoun Kim, Kyung-Sook bae, Ju-Hyun Yu, and
Tae-Kwang Oh( 1998), “Purificcation and properties of a thermostable phytase
from Bacillus sp.DS11”, Enzym and Microbial Technology.
Trang web điện tử
[14].http://www.cynosura.org/index.php?option=com_content&view=article&id=1
33%3Anatto&catid=10%3Akhoahoc-congnghe&Itemid=82
[15].http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html
[16].http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center.html
[17].http://en.wikipedia.org/wiki/Phytase
[18].http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis
[19].http://en.wikipedia.org/wiki/Phytic_acid
[20].http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/enzymes/GetPage.pl?ec_number=3