Thạc Sĩ Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính ch

MỞ ĐẦU
Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc
nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một
cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và
một số chất tương tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân
giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.
Endo-β-1,4-glucanase được sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau
như động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt
ngũ cốc như đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên,
nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức
đa dạng như nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma
viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus).
Endo-β-1,4-glucanase được ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác
nhau như công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực
phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung
môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.
Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi
sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ
phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài:
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-
1,4-glucanase cao; b) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4-
glucanase.
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
CHưƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. ĐỊNH NGHĨA . 2
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI . 2
1.2.1. Nguồn gốc 2
1.2.2. Phân loại enzyme . 3
1.3. CẤU TRÚC . 5
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất 5
1.3.2. Cấu trúc không gian . 6
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC 8
1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae 10
1.6. Ứng dụng 11
1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 11
1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12
1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi . 13
1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 14
1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 14
1.7. ẢNH HưỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRưỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 16
1.7.1. Nguồn carbon . 16
1.7.2. Nguồn nitrogen 17
1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy . 18
1.7.4. Ảnh hưởng của pH môi trường . 18
1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME . 19
1.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ . 19
1.8.2. Ảnh hưởng của pH . 20
1.8.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại . 20
1.8.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa . 21
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 22
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22
2.1.1. Chủng giống . 22
2.1.2. Thiết bị . 22
2.1.3. Hóa chất . 22
2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào . 23
2.1.5. Môi trường . 24
2.2. PHưƠNG PHÁP . 25
2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme . 25
2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase 25
2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh
tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27
2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 29
2.2.6. Điện di SDS-PAGE 30
2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase . 30
2.2.8. Các phương pháp sinh học phân tử . 32
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-
glucanase cao . 36
3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S
rRNA 37
3.3. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase . 39
3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian . 39
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng . 40
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon . 41
3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ carbon 43
3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 44
3.3.6. Ảnh hưởng của nồng độ nitrogen . 45
3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy . 46
3.3.8. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy . 47
3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase . 48
3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 50
3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ưu 50
3.5.2. pH phản ứng tối ưu . 51
3.5.3. Độ bền nhiệt . 52
3.5.4. Độ bền pH 54
3.5.5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ . 55
3.5.6. Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa 56
3.5.7. Ảnh hưởng của ion kim loại . 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
KẾT LUẬN 59
KIẾN NGHỊ . 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
TIẾNG VIỆT . 61
TIẾNG ANH 64
PHỤ LỤC 69