Thạc Sĩ Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính c

MỞ ĐẦU

Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.

Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác tạo thành các oligosaccharide.
Endo-β-1,4-glucanase có thể được sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xương sống khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ưu của các enzyme.
Hiện nay, việc sử dụng các enzyme như endo-β-1,4-glucanase trong một số ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu cơ và xử lý môi trường là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn.
Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan được sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nước hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các enzyme như endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do

trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4- glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch được endo-β-1,4- glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó.




MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHưƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE 3

1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 4

1.2.1 Nguồn gốc . 4

1.2.2 Phân loại 6

1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 7

1.3.1 Cấu trúc bậc một 7

1.3.2 Cấu trúc không gian . 9

1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất . 9

1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 11

1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 12

1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm . 12

1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc . 13

1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 15

1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy . 15

1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa 16

1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 16

1.6 ẢNH HưỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRưỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE . 17

1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 20

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM 22

CHưƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP 25

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT . 25

2.1.1 Chủng nấm 25

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 25

2.1.3 Hóa chất 26

2.1.4 Môi trường 26


2.1.5 Dung dịch và đệm 27

2.2 PHưƠNG PHÁP . 28

2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật . 28

2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 28

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase 30
2.2.4 Tinh sạch enzyme 32

2.2.5 Điện di SDS-PAGE . 33

2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase . 34

2.2.7 Xác định hàm lượng protein tổng số . 35

2.2.8 Các phương pháp sinh học phân tử 36

2.2.9 Xử lý số liệu 41

CHưƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 42

3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI

SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 42

3.1.1 Tuyển chọn 42

3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA 43

3.2 TỐI ưU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE 45

3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian . 45

3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 47

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 48

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon 50

3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen . 52

3.2.6 pH môi trường nuôi cấy ban đầu 54

3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 55

3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 55

3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE 56

3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE . 57

3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 57


3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ưu . 58

3.4.3 pH phản ứng tối ưu 60

3.4.4 Độ bền nhiệt độ . 61

3.4.5 Độ bền pH . 63

3.4.6 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ . 64

3.4.7 Ảnh hưởng của ion kim loại . 65

3.4.8 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 71

PHỤ LỤC . 79