Luận Văn Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinhenzyme Cellulase

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinhenzyme Cellulase


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC HÌNH . v
DANH MỤC BẢNG . vi
MỞĐẦU 1
PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀCELLULOSE 3
1.1.1. Giới thiệu vềcellulose . 3
1.1.2. Tìm hiểu vềcây sắn và bã sắn . 4
1.1.3. Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu 4
1.2. TỔNG QUAN VỀENZYME 5
1.2.1. Lịch sử pháttriển enzyme học . 5
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme . 9
1.2.3. Giới thiệu vềcellulase . 9
1.2.3.1. Cấu trúc của enzyme cellulase 10
1.2.3.2. Tính chất của enzyme cellulase 11
1.2.3.3. Cơ chếtác dụng của enzyme cellulase 11
1.2.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose . 12
1.2.5. Ứng dụng của enzyme cellulase . 12
1.2.6. Tình hình nghiên cứu vềenzyme cellulase 14
1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thếgiới 14
1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước . 15
1.3.TỔNG QUAN VỀ BACILLUS . 15
1.3.1. Đại cương về Bacillus . 15
1.3.2. Một sốvi khuẩn Bacillusthường gặp trong tựnhiên: 16
1.4. TỔNG QUAN VỀVẬT LIỆU NGHIỂN CỨU 20
PHẦN II NGUYÊN VẬT LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU 23
iii
2.1.1. Đối tượng 23
2.1.2. Vật liệu 23
2.1.2.1. Thiết bị . 23
2.1.2.2. Hoá chất . 23
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (g/ml) 24
2.1.3.1. Môi trường NA (dùng đểphân lập, giữgiống) 24
2.1.3.2. Môi trường thửhoạt tính enzyme cellulose . 24
2.1.3.3. Môi trường nuôi thu enzyme cellulase 24
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25
2.2.1. Phương pháp phân lập . 25
2.2.2. Phương pháp giữgiống . 26
2.2.3. Một sốphương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 26
2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc . 26
2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản cốđịnh . 27
2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram . . 27
2.2.4. Phương pháp định tính khảnăng sinh enzyme cellulase . 28
2.2.5.Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô 28
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độenzymecellulase . 28
2.2.6.1. Phương pháp đục lỗthạch 28
2.2.6.2.Phương pháp xác định hàm lượng đường khử . 28
2.2.6.3. Phương pháp tính hoạt độhệenzyme cellulase . 29
2.2.7. Bốtrí thí nghiệm . 31
2.2.7.1. Thí nghiệm xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
cellulase 31
2.2.7.2. Thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh enzyme
cellulase tốt nhất . 33
2.2.7.3. Ứng dụng enzyme cellulase của chủng Bacillus tuyển chọn vào việc
thủy phân cellulose có trong bã sắn . 35
PHẦN 3 KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37
iv
3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP MILLER . 37
3.2. TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME
CELLULASE TỐT NHẤT 38
3.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillustừthực phẩm lên men Natto . 38
3.2.2. Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng Bacillussinh
enzyme cellulase . 38
3.2.3. Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 39
3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc 39
3.2.3.2. Hình thái vi khuẩn 39
3.2.4. Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 đểchọn
chủng sinh enzyme mạnh nhất 41
3.2.4.1. Xác định địnhtính hoạt tính cellulase . 41
3.2.4.2. Dựa vào định lượng Glucose bằng phương pháp đo quang Miller để
xác định hoạt độenzyme cellulase 43
3.3. ĐIỀU KIỆN ĐỂENZYME CELLULASE CÓ HOẠT TÍNH CAO
NHẤT 47
3.3.1. Nghiên cứu nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 44
3.3.2. Nghiên cứupH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase . 44
3.4. NUÔI CẤY THU ENZYME CELLULASE . 44
3.4.1. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
cellulase 47
3.4.2. Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
cellulase 48
3.5. BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢNĂNG THỦY PHÂN CELLULOSE TRÊN MÔI
TRƯỜNG BÃ SẮN . 50
KẾT LUẬN 53
ĐỀXUẤT Ý KIẾN 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 54
PHỤLỤC . 57
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúcphân tửcellulose 3
Hình 1.2: Cấu trúckhông gian của enzymecellulase . 10
Hình 1.3: Cơ chếtác dụng của enzyme cellulase lên cellulose . 11
Hình 2.1:Sơ đồphân lập Bacillustừthực phẩm lên men Natto . 25
Hình 2.2: Ống nghiệm giữgiống Bacillus 26
Hình 2.3: Sơ đồxác định các điền kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase
32
Hình 2.4: Sơ đồcác điều kiện nuôi cấy Bacillusthích hợp đểsinh tổng hợp enzyme
cellulase 34
Hình 2.5: Ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân cellulose trong bã sắn 36
Hình 3.1: Đồthịđường chuẩn glucose theo phương pháp Miller . 38
Hình 3.2: Cấy ria chủng Bacillustrên đĩa petri 38
Hình 3.3: Vòng thủy phân CMC 1% của các chủngBacillus . 38
Hình 3.4:Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B1 . 40
Hình 3.5: Tiêu bản nhuộm Gramcủa chủng B3 . 40
Hình 3.6: Tiêu bản nhuộm Gramcủa chủng B7 . 41
Hình 3.7: Vòng thủy phân cellulose của 3 chủng B1, B3, B7 . 42
Hình 3.8: Biểu diễn hoạt độenzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 . 43
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độđến hoạt tínhenzyme cellulase 44
Hình 3.10: pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase. . 46
Hình 3.11: pH ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợpenzyme cellulase. 47
Hình 3.12: Thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase . 49
Hình 3.13: Ủbã sắn với enzyme cellulase . 50
Hình 3.14: Lượng Glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cellulose của enzyme
cellulase trên 1g môi trường bã sắnkhô 51
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1:Thành phần trong bã sắn 4
Bảng 1.2: Một sốvi sinh vật sản xuất cellulase. . 12
Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose . 29
Bảng 2.2:Xác định hoạt độcellulase . 30
Bảng 3.1: Đường kính vòng thủy phân của các chủng Bacillus 39
Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân của 3 chủng B1, B3, B7 42
Bảng 3.3: Lượng Glucose (%) sinh rakhi thủy phân cellulose trong 100g bã sắn 52
1
MỞ ĐẦU
Vi sinh vật trong tựnhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ởxung quanh ta:
trong đất, nước, không khí, thậm chí trong cơ thểcon người. Chúng có thểgây ra
các bệnh khôn lường như bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ởngười và gia
cầm, lởmồm, long móng ởbò lợn . nhưng chúng cũng đem lại cho ta nguồn lợi vô
cùng to lớn nếu ta biết hiểu chúng và biết sửdụng chúng có mục đích sẽgiúp cuộc
sống của con người tốt đẹp hơn.
Từxa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật
phục vụcho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờquá trình lên men
của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từvi sinh vật .
Ngày nay chúng ta đang sống trong thếkỷ21, thếkỷcủa khoa học công nghệ
và đặc biệt là công nghệvi sinh càng chứng tỏưu thếcủa mình.
Hiện nay đã có nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ
vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ởmức độcông nghiệp đểphục vụcho nghiên
cứu, công –nôngnghiệp, y học và đời sống của con người.
Các chủng vi khuẩn như:Bacillus, LactoBacillus . đã và đang được sửdụng
trong các chếphẩm sinh học đểphục vụcho các nghành sản xuất như: rượu, bia,
công nghệdệt, y học, bổsung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy
sản, phếthải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản . là nhờkhảnăng
sinh ezyme thủy phân amylase, protease, cellulase . của chúng.
Các nhà máy chếbiến thực phẩm được hình thành và phát triển ngày càng
nhiều. Bên cạnh đó, các chất thải được thải ra môi trường ngoài với một lượng lớn.
Điển hình như nhà máy chếbiến tinh bột từcủsắn, vào vụthu hoạch có khoảng 100
–150 tấn bã sắn được thải ra hằng ngày. Lượng bã sắn tồn đọng là nguyên nhân gây
ô nhiễm môi trường. Với mong muốn tận dụng lại nguồn bã sắn đểlàm thức ăn
chăn nuôi cho gia súc: bằng cách sửdụng enzyme cellulase phân lập từvi sinh vật
đểphân giải cellulose thành các sản phẩm dễtiêu hóa như đường . kết hợp bổsung
các chất phụgia khác như cám gạo, rỉđường . tăng thành phần dinh dưỡng. Nhờ
2
đó, ta chuyển phếliệu thành một sản phẩm có ích trong chăn nuôi sẽgiảm thiểu nạn
ô nhiễm môi trường.
Xuất phát từthực tếđó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đềtài:
‘‘Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinhenzyme Cellulase”
Nội dung
- Tuyển lựachủng Bacillussinh enzymecellulase.
- Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân củaenzyme
thu được.
- Sơ bộ đánh giá khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩnBacillusphân
lập được.
Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn là 3 tháng không tránh khỏi hạn
chế và thiếu sót. Tôi rất mong nhận được các ý kiến bổ ích của những ai quan
tâm đến đề tài để hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
3
PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE
1.1.1.Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra người ta thường thấy
chúng có nhiều ởtếbào của một sốloài vi sinh vật. Ởtếbào thực vật và một sốtế
bào vi sinh vật, chúng tồn tại ởdạng sợi.
Cellulose không có trong tếbào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các β-Dglucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside. Các gốc glucose trong glucose thường lệch nhau một góc 180
0
C và có
dạng như một chiếc ghếbành. Cellulase thường chứa 10.000 –14.000 gốc đường và
được cấu tạo như Hình 1.1.
Hình 1.1: Cấu trúc phân tửcellulose
Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có
khảnăng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản
phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã đểlại trong môi trường lượng lớn rác thải
hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạkhuẩn có khảnăng phân hủy
cellulose thành các sản phẩm dễphân hủy nhờenzyme cellulase [5].
4
1.1.2.Tìm hiểu vềcây sắn và bã sắn
Cây sắn
Cây sắn trồng rất nhiều ởnước ta chủyếu đểlấy củ, cây có chiều cao 1 –3m,
thân có 3 lõi đơn hoặc phân nhánh, các lá có thùy sâu, dạng chân vịt.
Củsắn có kích thước trung bình dài 25 –38cm. Tùy theo giống, điều kiện đất
đai và thời gian thu hoạch mà củsắn có kích thước lớn hơn hoặc nhỏhơn trịsố
trung bình.
Cấu tạo củsắn gồm 4 phần chính: vỏgỗ, vỏthịt, thịt sắn và lõi sắn.
Bã sẵn
Hiện nay ởnước ta có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng công suất khoảng
38 triệu tấn củsắn tươi/năm. Theo ước tính một nhà máy chếbiến tinh bột sắn có
công suất 30 –100 tấn/ngày sẽsản xuất được 7,5 –25 tấn tinh bột, kèm theo đó là
12 –48 tấn bã bao gồm 2 loại:
 Loại 1: Bã thải do quá trình rửavà bóc vỏ gỗ chiếm tỉ trọng ít và thành phần
chủ yếu là cellulose, hemixenlulose và cát, sạn.
 Loại 2: Phần bã còn lại sau khi tách tinh bột gọi là bã sắn.
Bảng 1.1:Thành phần trong bã sắn
Thành phần Hàm lượng (%)
Protein 1,82 –2,03
Chất béo 0,09 –0,2
Tro 1,61 –2,38
DNF (%DM) 31,2
Tinh bột 60,84 –65,9
Cacbohydrat 72,19 –79,51
Độ ẩm 80,16 –85,5
1.1.3.Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu
Bã sắn nguyên liệu chứa độ ẩm cao và một sốchất như tinh bột, chất béo . rất
dễbịvi khuẩn phân hủy gâyra mùi hôi thối gây ô nhiễm môi trường. Từ Bảng 1.1
trong thành phần bã sắn tươi còn chứa một sốchất dinh dưỡng do đó ta có thểtận
dụng đểbiến phếliệu thành một sản phẩm khác có ích hơn phục vụcho những mục
đích nhất định.
5
 Ở Việt Nam
- Làm thức ăn cho động vật nhai lại.
- Sản xuất thức ăn chăn nuôicó giá trị cao.
- Sản xuất cồn sinh học.
 Thế giới
- Tạo chất kết dính cho sản xuất diêm.
- Dùng làm phân bón.
- Dùng làm thức ăn gia súc.
- Sản xuất etanol sinh học.
- Vấn đề nghiên cứu nhiên liệu sinh học thay thế cho xăng cũng được nhiều
nước trên thế giới quan tâm. Thái Lan là nước sản xuất thành công etanol sinh học
từ bã sắn, thành công này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng vì nước này phải nhập 2/3
nguồn năng lượng từ nước ngoài.
Bã sắn đã được tận dụng trong rất nhiều lĩnh vực đểgiảm thiểu ô nhiễm môi
trường. Tuy nhiên ởViệt Nam thì điều này cònhạn chế. Với đềtài phân lập
Bacilluscó hoạt tính cellulase. Và bước đầu ứng dụng chủng Bacillusphân hủy
cellulose trong bã sắn đểlàm thức ăn trong chăn nuôi. Tôi muốn góp một phần nhỏ
bé trong công cuộc bảo vệmôi trường ởnước ta.
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME
1.2.1.Lịch sử pháttriển enzyme học [9]
Enzyme là những protein có khảnăng xúc tác cho các phản ứng hóa học với
mức độđặc hiệu khác nhau ởnhiệt độtương đối thấp. Enzyme có trong tất cảcác tế
bào sống, là chất xúc tác sinh học. Enzyme có đầy đủcác tính chất của chất xúc tác,
nhưng enzyme có hiệu xuất xúc tác lớn hơn tất cảcác chất xúc tác vô cơ và hữu cơ
khác. Ezyme không những có thểxúc tác cho các phản ứng xảy ratrong cơ thể
sống, mà sau khi tách khỏi hệthống sống, ởnhững điều kiện nhất định chúng vẫn
giữđược hoạt tính xúc tác.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
 TIẾNG VIỆT
[1]. Nguyễn Lân Dũng. Thực hành vi sinh vật học (1983). NXB Đại học và Trung
học chuyên nghiệp, Hà Nội.
[2]. Nguyễn Thành Đạt, Thực hành vi sinh (1990), NXB Nông Nghiệp.
[3]. Nguyễn Minh Trí và Nguyễn ThịThanh Hải, Thực hành vi sinh vật Đại Cương
(2009), tr. 7-10.
[4]. Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếutố ảnh hưởng đến khảnăng sinh
tổng hợp cellulase của một sốchủng vi sinh vật đểxửlý rác. Báo cáo Khoa học,
HộinghịCông nghệSinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹthuật, Hà Nội, tr.
333-339.
[5]. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn SỹLê Thanh (2007), Tuyển chọn và
nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tốmôi trường lên khảnăng sinh tổng hợp
cellulase của chủng Penicilium sp. DTQ-HK 1. Tạp chí Công nghệSinh học 5(3),
tr. 355-362.
[6]. Trần ThịÁnh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010), Khảo sát các điều kiệnnuôi cấy
và phương pháp tách chiết Enzyme Cellulase từvi khuẩn Bacillus subtilis, Tuyển
tập Báo cáo hội nghịsinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ7, Đại học Đà Nẵng.
[7]. Tăng ThịChính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất
Cellulase của một sốchủng vi sinh vật ưa nhiệt phân lập từbể ủrác thải. Báo cáo
Khoa học, Hôi nghịCông nghệSinh học toàn quốc. NXB Khoa học Kỹthuật, Hà
Nội, tr. 790-797.
[8]. Lương Đức Phẩm. Chếphẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy
sản(2007). NXBNông Nghiệp.
[9]. Phạm ThịTrân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học enzyme và
protein, tr. 9-94.
[10]. Phạm ThịNgọc Lan, Phan ThịHòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn một
sốchủng xạkhuẩn có khảnăng phân giải cellulose từmùn rác, Báo cáo Khoa
55
học, Hội nghịCông nghệSinh học toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹthuật, Hà
Nội, tr. 177-182.
 TIẾNG ANH
[11]. Howard RL, Abotsi E., Jansen Van Rensburg and S. Howard (2003),
Lignocellulose Biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production,
African Journal of Biotechnology Vol. 2 (12), p. 602-619, December 2003.
[12]. Miller,(1959)Use of dinitro salicylic acid reagent for determination of
reducing sugar, Anal. Chem 31(3), p. 426-428
[13]. Ogawa K, Toyama D, Fujji N (1991), “Microctystalline cellulase hydrolyzing
cellulase from trichoderma reseu CDU-II”. Journal of General and Applied
Microbiology, Vol 37, p. 249-259.
[14]. Ozaki K, Ito (1991), Purification and propertiesof and acid endo-1-4-glucanase
from Bacillussp. KSM 330, Joumal of GeneralMicrobiology. Vol. 137, P. 41-48.
[15]. Rosovitz. MS, Voskuil, MI, Chambliss, G.H (1998) Bacillusin: A.Balows and
BI. Ducerden (Eds), Systematic Bacteriology Arnold Press, Lon Don: 709-720.
[16]. Schallemey, M., Singh, A. and Ward, O.P. (2004), Developments in the use of
Bacillusspecies for industrial production. Can. J. Microbiol. 50,1-7.
[17]. Peter f. Strom (1985), Indentification of Thermophilic Bacteria in Solid –
Waste Composting, Applied and Environmental microbiology, p. 906-913.
[18]. Priest, F.G and Grigorocy R (1991) Method for dtudying the ecology of
endopore –forming Bateria. Method in microbiology 22, 265-591. Todar, K, Ph.
D(2008)Bacillusand related related abdospore –forming bacteria. Todar’s online
texbook of bacteriology.
[19]. Willick V, Seligy L (1985), Multiplicity in cellulases of schizopyllum
commune derivation party from heterogeneity in transcription and glycosilation
European Journal of Biochemistry. Vol. 151, p 89-96.
56
 TRANG WEB ĐIỆN TỬ
[20]. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus
[21]. http://cynosura.org/endex.php
[22]. http://vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/ykhoa/natto02.htm
[23]. www.epa.gov/opptintra/biotech/fra/fra009htm.