Tài liệu Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng

ĐỀ TÀI: Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng

PHẦN MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme thủy phân lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [43].
Protease có thể được thu từ cỏc nhúm sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật trong đó nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất. Động vật và thực vật chỉ có khả năng sinh ra một trong hai loại enzyme protease là endoprotease hoặc exoprotease, trong khi vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên. Do đó, protease của vi khuẩn có phổ ứng dụng rộng, hiệu suất sử dụng cao, có khả năng phân hủy triệt để các liên kết peptide trong phân tử protein [66]. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease thuộc loài Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số loài thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Tuy nhiên, các vi khuẩn đất hoặc vi khuẩn nước ngọt thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính hoặc kiềm yếu và kém chịu mặn do đó việc ứng dụng c̣n hạn chế.
Việc nghiên cứu các chủng Bacillus chịu mặn và sinh protease kiềm chưa được nghiên cứu nhiều. Lần đầu tiên các chủng này được nghiên cứu là vào năm 1968, các chủng ưa kiềm phát triển thuận lợi nhất ở điều kiện pH 9 và có thể ở pH 10 – 12, chúng không phát triển hoặc phát triển rất kém ở điều kiện pH 6,5 [44]. Những phát hiện ban đầu về những chủng ưa mặn và ưa kiềm trên là vô cùng quan trọng, đă mở ra các hướng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất như: chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp
Việt Nam có đường bờ biển dài trên 3000 km và khoảng 3000 ḥn đảo ven bờ, do vậy các loại h́nh đất ngập nước ven bờ rất phong phú như (rừng ngập mặn, băi triều lầy, vịnh, ven đảo, cửa sông, rạn san hô .) và có tính đa dạng sinh học cao. Theo báo cáo của Cục Môi trường (Bộ TNMT, 2007), trong tổng số 621.162 ha đất ngập nước (ngập mặn) ven biển của Việt Nam có 209.741 ha RNM, 226.111 ha nuôi trồng thủy sản và 185.310 ha đất ngập mặn chưa có rừng (2008) [90]. Kốm theo đó, nghiên cứu khu hệ vi sinh vật rừng ngập mặn đă và đang được tiến hành tại bộ môn Công nghệ sinh học-vi sinh, với bộ sưu tập hơn 600 chủng Bacillus phân lập được. Một số nghiên cứu về Bacillus từ RNM đă được tiến hành nhưng chưa có nghiên cứu mang tính hệ thống về khả năng sinh protease kiềm của các chủng Bacillus phân lập được từ RNM Việt Nam.
Xuất phát từ t́nh h́nh thực tế nghiên cứu và vai tṛ ứng dụng quan trọng của protease kiềm chúng tôi chọn đề tài: “Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng ”
Nội dung cụ thể của đề tài gồm:
1. Hoạt hóa lại các chủng Bacillus rừng ngập mặn.
2. Tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzyme protease kiềm.
o Xác định khả năng sinh protease kiềm (pH 9) của các chủng Bacillus.
o Tuyển chọn các chủng có hoạt tính protease kiềm đầu ḍng.
3. Xác định môi trường thích hợp cho Bacillus sinh protease kiềm.
4. Lên men thu chế phẩm enzyme thô, xác định hoạt tính protease.
5. Nghiên cứu đặc tính lư hóa của dịch enzyme thô đă loại bỏ sinh khối: như ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl đến độ bền và hoạt tính của enzyme.
6. Bước đầu xác định khả năng tẩy lông của protease trên da ḅ.

PHẦN NỘI DUNG
Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Các enzyme thủy phân protein
Protease thuộc enzyme nhóm 3 (enzyme phân giải) và phân nhóm 3.4 (phân cắt các liên kết peptide). Dựa vào vị trí cắt đứt liên kết trong chuỗi liên kết peptide, người ta chia protease làm 2 nhóm: Endopeptidase và Exopeptidase [65]. Protease xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide (-CO-NH[SUB]2[/SUB]-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự. Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin [2].


H́nh 1.1. Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử protein




















H́nh 1.2. Sơ đồ phân loại protease [65]
1.1.1. Exopeptidase
Exopeptidase chỉ tác dụng ở gần điểm kết thúc của chuỗi polypeptide, tại đầu N hoặc đầu C. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:
a/ Aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. Trong quá tŕnh aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide, nếu giải phóng một amino acid gọi là aminopeptidase, giải phóng một dipeptide được gọi là dipeptidyl-peptidase và giải phóng một tripeptide được gọi là tripeptidyl-peptidase.
b/ Carboxypeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. Trong quá tŕnh exopeptidase tác dụng tại đầu C, nếu giải phóng một amino acid gọi là cacboxyl-peptidase hoặc giải phóng một dipeptide gọi là peptidyl-dipeptidase.
1.1.2. Endopeptidase
Endopeptidase tác động ở vùng bên trong của chuỗi liên kết peptide, cách xa 2 đầu C và N. Dựa vào cơ chế tác động của endopeptidase, người ta chia chúng thành 4 nhóm: serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease.
a/ Serine protease (EC.3.4.21) là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính [23]:
ü Bước 1, acyl hóa: h́nh thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử các bon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, ṿng imidazole và một amin (phản ứng khử).
ü Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H[SUB]2[/SUB]O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhúm amin để tái sinh lại enzyme.
Serine protease có 1 serine ở trung tâm hoạt động, nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN.
Serine protease có mặt trong rất nhiều loài của Aspergillus và Bacillus. Các enzyme này bị ức chế bởi Phenylmethylsulgonyl fluorid (PMSF) hoặc diisopropyl fluorophosphat (DFP). Phần lớn enzyme này hoạt động tối thích trong khoảng pH từ 7 – 11 và có trọng lượng phân tử khoảng 20000 – 35000 dalton.
b/ Cysteine protease (EC.3.4.22) có 1 cysteine ở trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papayin, bromelin, một vài protease động vật và kư sinh trùng và ít thấy ở nấm. Phần lớn các enzyme này hoạt động tối thích ở pH từ 5 – 8, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Chúng mẫn cảm với các chất chứa sulphydryl như là P-chloromercuri benzoate.
c/ Aspartic protease (EC.3.4.23) có 2 axit aspartic ở trung tâm hoạt động, là enzyme quan trọng thứ 2 trong số các protease công nghiệp sau serine protease. Chúng chủ yếu là các protease axit với một axit aspartic được coi như ch́a khóa phân giải trong vùng tác động. Enzyme này hoạt động tốt nhất ở khoảng pH từ 3 – 4, với trọng lượng phân tử từ 30.000 – 45.000 dalton. Aspartic protease rất phổ biến ở nấm và không ổn định ở pH 7,0.
d/ Metallo protease (EC.3.4.24) sử dụng ion kim loại trong trung tâm hoạt động, enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH 5 – 9, mẫn cảm với các EDTA nhưng không bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế của serine protease hoặc thuốc thử sulphydryl. Kẽm, Coban hoặc Canxi, Mangan hoạt hóa trở lại khi bị EDTA làm bất hoạt [83]. Phần lớn các metallo protease là enzyme có chứa Kẽm, cấu trúc phân tử protein luôn ổn định bởi sự có mặt của Canxi. Đáng chú ư ở các enzyme này là phần lớn ưa nhiệt và rất phổ biến ở Bacillus thermoproteolyticus [56].










H́nh 1.3. Sơ đồ vị trí tác động của protease thủy phân trên phân tử protein
Endopeptidase là một trong những thành phần quan trọng nhất của nhóm enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng số enzyme đă được sử dụng rộng răi [59], [26], [32]. Trong số các loại protease từ vi sinh vật, protease vi khuẩn là đáng kể nhất. Trong số các vi khuẩn th́ Bacillus là sinh vật đặc trưng sinh protease ngoại bào. Protease có một số đặc điểm rất lư tưởng đối với công nghệ sinh học, v́ vậy chúng trở thành một trong những enzyme quan trọng nhất trong sản xuất công nghiệp. Những protease này được ứng dụng rộng răi trong các nghành công nghiệp như dược phẩm, thuộc da, tẩy rửa, thực phẩm và công nghiệp xử lư rác thải [80].
1.2. Protease từ vi sinh vật