Thạc Sĩ Tổng hợp và kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope kháng nguyên ha virus cúm a/h5n1 được nhận di

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vaccine phòng ngừa một số phân type cúm hiện nay tuy có hiệu quả tốt nhưng lại bị giới hạn về chủng. Do đó, nhiều phương pháp mới được nghiên cứu nhằm cải thiện các hạn chế của vaccine hiện có và chủ yếu tập trung vào hai hướng sau: i) Tạo vaccine đa giá phòng được nhiều chủng virus; ii) Con đường tạo sự miễn dịch. Trong đó, phương pháp nghiên cứu tạo vaccine dựa trên các epitope bảo tồn ở các chủng virus thuộc các phân type khác nhau của virus cúm A hiện đang được quan tâm rộng rãi. Ưu điểm của loại vaccine này là khả năng gây đáp ứng miễn dịch chỉ với cấu trúc kháng nguyên tối thiểu. Vì vậy, nếu có đầy đủ các epitope cần thiết, vaccine sẽ kích thích phản ứng miễn dịch chuyên biệt mà không gây ra những ảnh hưởng không mong muốn. Cùng với sự phát triển của ngành Tin Sinh học, nhóm nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (PTN.CNSHPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Trường ĐHKHTN) thuộc Đại học Quốc gia TP. HCM (ĐHQG - HCM) quan tâm đến hướng nghiên cứu nêu trên. Trong các năm 2008 – 2010, PTN.CNSPT đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao chủ trì triển khai một đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước là “Nghiên cứu ứng dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vaccine và thuốc”, mã số KC.04.18/06-10. Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope được nhận diện bởi tế bào T, tế bào B từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A bằng các chương trình dự đoán epitope khác nhau và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope dự đoán. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài chưa đánh giá được hết tất cả các epitope đã được dự đoán từ kết quả của đề tài. Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành tổng hợp bằng kỹ thuật gen một epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B đã được dự đoán từ kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 và tiến hành đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể nhận diện kháng nguyên của epitope này. Để tổng hợp epitope bằng kỹ thuật gen, epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B (HAeB) được thiết kế để tổng hợp thành protein tái tổ hợp trong tế bào chủ E. coli ở dạng dung hợp với GST (Glutathione S-transferase) và kháng nguyên roi (flagellin) H:1,2 của Salmonella Typhimurium. Do vector được sử dụng để biểu hiện protein trong E. coli được chọn thuộc hệ thống pVFT, được thiết kế để biểu hiện protein ngoại lai ở dạng dung hợp với GST, nên epitope tái tổ hợp cũng được tổng hợp ở dạng dung hợp với GST. Ngoài ra, do flagellin H:1,2 của S. Typhimurium đã được chứng minh có hoạt tính kích thích đáp ứng miễn dịch ở vật chủ, nên chúng tôi thiết kế epitope dung hợp với H:1,2 với mục đích tăng cường khả năng gây đáp ứng miễn dịch của epitope tổng hợp. Epitope tái tổ hợp được tổng hợp bằng kỹ thuật gen sẽ dung hợp với GST và H:1,2 ở đầu N (GST-H:1,2-HAeB).
Nội dung thực nghiệm của luận văn gồm:
- Tạo dòng tế bào E. coli biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
- Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng tổng hợp epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
- Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
- Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch đặc hiệu của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2- HAeB với kháng nguyên HA của virus A/H5N1.

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG . iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA VIRUS CÚM H5N1 3
1.1.1. Đặc điểm và cấu tạo virus cúm A/H5N1 . 3
1.1.2. Chu trình nhân bản . 4
1.1.3. Cơ chế tiến hóa . 5
1.2. CÁC LOẠI VACCINE PHÒNG NGỪA VIRUS CÚM A/H5N1 6
1.2.1. Vaccine truyền thống 6
1.2.2. Vaccine thế hệ mới . 6
1.2.3. Nghiên cứu, phát triển vaccine epitope tái tổ hợp trên thế giới 8
1.2.4. Tình hình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam 9
1.3. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG PROTEIN HEMAGGLUTININ (HA) . 10
1.3.1. Cấu trúc 10
1.3.2. Chức năng 10
1.4. TẾ BÀO LYMPHO B VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH DỊCH THỂ . 11
1.4.1. Tế bào lympho B 11
1.4.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể 12
1.5. EPITOPE VÀ TÍNH CHẤT CỦA CÁC EPITOPE ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI TẾ BÀO B . 13
1.5.1. Epitope . 13
1.5.2. Tính chất của các epitope được nhận diện bởi tế bào B . 13
1.6. DỰ ĐOÁN EPITOPE TRÊN CÁC KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG CÁC CÔNG CỤ TIN – SINH HỌC . 14
1.7. TÁ DƯỢC VACCINE 16
1.7.1. Sơ lược về tá dược 16
1.7.2. Flagellin và triển vọng sử dụng làm tá dược . 17
1.7.3. Freund’s adjuvant . 18
1.8. HỆ THỐNG DUNG HỢP VỚI PROTEIN GLUTATHIONE STRANSFERASE 18
1.9. NGUYÊN TẮC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN . 19
1.9.1. Biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào E. coli . 19
1.9.2. Vector biểu hiện trong E. coli . 20
1.9.3. Phương pháp tinh chế sắc ký ái lực . 21
1.9.4. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên động vật để thu nhận kháng thể đa dòng . 22
1.9.5. Phương pháp ELISA để kiểm chứng tính kháng nguyên của epitope HA tái tổ hợp 23
PHẦN 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU . 26
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị . 26
2.1.2. Vật liệu sinh học . 26
2.1.3. Hóa chất – Môi trường 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 33
2.2.1. Qui trình tạo dòng tế bào E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab có khả năng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB . 33
2.2.2. Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR và xử lý bằng enzyme EcoRI - SalI . 34
2.2.3. Thu nhận và cắt mở vòng plasmid pVFT-hab chứa gen mã hóa epitope HAeB 36
2.2.4. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp PVFT-fljB-hab 37
2.2.5. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab biểu hiện epitope dung hợp GST-H:1,2-HAeB 40
2.2.6. Cảm ứng, biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 41
2.2.7. Tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện epitope tái tổ hợp GSTH: 1,2:HAeB trong chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab . 44
2.2.8. Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB . 46
2.2.9. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 48
2.2.10. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB bằng phương pháp ELISA gián tiếp 49
2.2.11. Kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB và protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB . 51
2.2.12. So sánh khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2- HAeB với vaccine thương mại . 52
PHẦN 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. TẠO DÒNG VECTOR TÁI TỔ HỢP pVFT-fljB-hab 53
3.1.1. Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR . 53
3.1.2. Thu nhận plasmid pVFT-hab/EcoRI, SalI . 53
3.1.3. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector pVFT-fljB-hab 54
3.1.4. Sàng lọc và kiểm tra các dòng tế bào E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab 55
3.1.5. Giải trình tự đoạn gen fljB-hab đã tạo dòng 57
3.2. TẠO DÒNG E. COLI BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab CÓ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2-HAeB 57
3.2.1. Biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E. coli BL21(DE3) . 57
3.2.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pVFT-fljB-hab từ dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab . 58
3.2.3. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 59
3.3. TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN EPITOPE TÁI TỔ HỢP GSTH:
1,2- HAeB 61
3.3.1. Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG 61
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp63
3.3.3. Ảnh hưởng của ôxi hòa tan lên sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp . 64
3.3.4. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB trong E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab ở các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa 66
3.4. THU NHẬN VÀ TINH CHẾ EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2-HAeB . 66
3.4.1. Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2:HAeB . 67
3.4.2. Xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp sau khi tinh chế 67
3.5. KIỂM CHỨNG HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU CỦA EPITOPE TÁI TỔ HỢP 68
3.5.1. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB tổng hợp hóa học 68
3.5.2. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2- HAeB 69
3.5.3. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh đối với virus H5N1 72
3.6. SO SÁNH KHẢ NĂNG GẮN VIRUS H5N1 BẤT HOẠT CỦA KHÁNG HUYẾT THANH CHUỘT TIÊM EPITOPE HAeB, EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2- HAeB VÀ VACCINE THƯƠNG MẠI . 74
PHẦN 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN 77
2. ĐỀ NGHỊ 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 79