Thạc Sĩ Tổng hợp dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm, amonium bậc bốn và khảo sát một số hoạt tính sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành : Hóa sinh
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
2010

MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Mục lục
Danh mục các thuật ngữ viết tắt
Danh mục các bảng Danh mục các hình ảnh Danh mục các đồ thị Danh mục các sơ đồ Danh mục các biểu đồ

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan chitin, chitosan . 1
1.1.1. Tổng quan chitin 1
1.1.2. Tổng quan chitosan 3
1.1.2.1. Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan và dẫn xuất chitosan . 3
1.1.2.2. Cấu tạo chitosan . 4
1.1.2.3. Tính tan của chitosan . 7
1.2. Ứng dụng chitosan và dẫn xuất chitosan . 8
1.2.1. Chitin và chitosan trong công nghiệp màng bao thực phẩm 8
1.2.2. Ứng dụng chitosan trong công nghệ lọc và khử acid nước trái cây 10
1.2.3. Ứng dụng chitosan để thu hồi protein và chất béo từ whey phomat . 10
1.2.4. Ứng dụng chitosan và chitin trong làm sạch nước 11
1.2.5. Ứng dụng hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất
trong công nghiệp chế biến thịt . 13
1.2.6. Ứng dụng chitin và chitosan để cố định enzyme . 13
1.2.7. Tổng hợp chitin oligomer và chitosan oligomer ứng dụng
trong thực phẩm chức năng 14

1.3.1. Dẫn xuất chitosan gắn đường . 18
1.3.2. Dẫn xuất N-aryl chitosan . 20
1.3.3. Dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan 21
1.3.4. Dẫn xuất carboxyalkyl của chitosan 23
1.4. Hoạt tính sinh học của chitosan và dẫn xuất chitosan 25
1.4.1. Hoạt tính kháng vi khuẩn của chitosan và các dẫn xuất 25
1.4.2. Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất . 28
1.4.3. Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và dẫn xuất 29
1.4.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa 29
1.4.3.2. Chất oxy hóa và chất kháng oxy hóa . 30
1.5. Tổng quan các chủng vi sinh thử nghiệm 35
1.5.1. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm 35
1.5.1.1. Staphylococcus aureus MSSA . 35
1.5.1.2. Staphylococcus aureus MRSA 36
1.5.1.3. Escherichia coli . 37
1.5.1.4. Pseudomonas aeruginosa 38
1.5.1.5. Salmonella typhi 40
1.5.2. Các chủng nấm bệnh thử nghiệm . 40
1.5.2.1. Sclerotium rolfsii . 40
1.5.2.2. Fusarium sp . 41

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu và thiết bị 44
2.1.1. Vật liệu . 44
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị . 45
2.2. Phương pháp . 46
2.2.1. Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR): xác định độ

2.2.3. Phương pháp phân tích phổ NMR xác định độ thay thế của phản ứng tạo dẫn xuất chitosan . 50
2.2.4. Phương pháp tạo dẫn xuất chitosan . 53
2.2.4.1. Tạo dẫn xuất chitosan với các aldehyde thơm . 53
2.2.4.2. Tạo dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan 54
2.2.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn . 56
2.2.5.1. Phương pháp đục lỗ thạch . 56
2.2.5.2. Phương pháp xác định MIC của các chất thử nghiệm . 57
2.2.6. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm 58
2.2.7. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa 59
2.2.7.1. Năng lực khử . 59
2.2.7.2. Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do 61

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Xác định độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình của chitosan . 63
3.1.1. Xác định độ deacetyl hóa của chitosan 63
3.1.2. Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitosan bằng phương pháp đo độ nhớt 64
3.2. Tổng hợp các dẫn xuất chitosan . 65
3.2.1. Hiệu suất thu nhận các dẫn xuất của chitosan . 65
3.2.2. Xác định độ thay thế và độ amonium bậc bốn hóa của các dẫn xuất chitosan . 66
3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 69
3.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất 69
3.3.2. MIC của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 73
3.3.2.1. MIC của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 73

3.3.2.2. MIC của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 75
3.3.2.3. MIC của N-Metylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 77
3.3.2.4. MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 79
3.3.2.5. MIC của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 81
3.3.2.6. MIC của N-Metylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 82
3.3.2.7. MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 84
3.4. Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuât trên các chủng nấm thử nghiệm . 87
3.4.1. Hoạt tính kháng nấm của chitosan . 87
3.4.2. Hoạt tính kháng nấm của N-Benzyl chitosan 89
3.4.3. Hoạt tính kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan . 91
3.4.4. Hoạt tính kháng nấm của N-Hydroxylbenzyl chitosan 93
3.4.5. Hoạt tính kháng nấm của N- Benzyl chitosan-Quat 94
3.4.6. Hoạt tính kháng nấm của N- Metylbenzyl chitosan-Quat . 96
3.4.7. Hoạt tính kháng nấm của N-Hydroxyl benzyl chitosan-Quat . 97
3.5. Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất của chitosan 102
3.5.1. Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất của chitosan 102
3.5.2. Khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và
các dẫn xuất của chitosan . 105

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận . 108
4.1.1. Độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình của chitosan . 108
4.1.2. Kết quả tạo các dẫn xuất của chitosan 108

4.1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất . 108
4.1.4. Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất 109
4.1.5. Hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất 110
4.2. Đề nghị . 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Mối tương quan giữa nồng độ chitosan và thời gian lưu trong phương pháp đo độ nhớt bằng nhớt kế Ubelloge 64
Bảng 3.2. Hiệu suất phản ứng thu nhận các dẫn xuất chitosan . 65
Bảng 3.3a: Độ thay thế (ES) của các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm theo công thức của Mrunal 67
Bảng 3.3b: Độ thay thế (ES) của các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm theo công thức của Warayuth . 67
Bảng 3.3c: Độ amonium bậc bốn hóa (DQ) của các dẫn xuất amonium bậc bốn chitosan 68
Bảng 3.4. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm của chitosan và các dẫn xuất chitosan . 70
Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 73
Bảng 3.6: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 75
Bảng 3.7: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Metylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 77
Bảng 3.8: Nồng độ kìm hãm tối thiểu của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 79
Bảng 3.9: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 81
Bảng 3.10: Nồng độ ứu chế tối thiểu của N-Metylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 83
Bảng 3.11: Nồng độ ức chế tối thiểu của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 84
Bảng 3.12: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của chitosan và các dẫn xuất chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 86

Bảng 3.13: Hiệu suất kháng nấm của chitosan ở các nồng độ khác nhau 87
Bảng 3.14: Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl chitosan ở các nồng độ khác nhau . 89
Bảng 3.15: Hiệu suất kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan ở các nồng độ khác nhau .91.
Bảng 3.16: Hiệu suất kháng nấm của N-Hyroxylbenzyl chitosan ở các nồng độ khác nhau . 92
Bảng 3.17: Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 94
Bảng 3.18: Hiệu suất kháng nấm của N-Metylbenzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau . 95
Bảng 3.19: Hiệu suất kháng nấm của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 97
Bảng 3.20: Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất ở các nồng độ khác nhau . 102
Bảng 3.21: Kết quả kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất ở các nồng độ khác nhau 104

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin . 1
Hình 1.2. Cấu tạo của α-chitin và β-chitin 2
Hình 1.3. Công thức cấu tạo chitosan . 4
Hình 1.4. Các nhóm chức hoạt động trên phân tử chitosan 5
Hình 1.5: Công thức cấu tạo chitin và chitosan 5
Hình 1.6. Phân tử chitosan “kẹp” ion Niken . 12
Hình 1.7: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất maltose-chitosan . 18
Hình 1.8. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất lactose-chitosan . 20
Hình 1.9. Tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan . 21
Hình 1.10. Phản ứng giữa chitosan và metyl iod tạo dẫn xuất trimetyl chitosan . 22

Hình 1.11. Phản ứng giữa chitosan và Quat 188 tạo dẫn xuất Chitsan-Quat 188 . 22
Hình 1.12. Phản ứng giữa chitin và DEAE-cloride tạo dẫn xuất TEAE-chitin 23
Hình 1.13. Dẫn xuất N và O carboxylalkyl chitosan 24
Hình 1.14. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-carboxymetyl chitosan 24
Hình 1.15. Công thức một số chất chống oxy hóa 33
Hình 1.16: Vi khuẩn Staphylococcus aureus MSSA 35
Hình 1.17: Vi khuẩn Staphylococcus aureus MRSA 36
Hình 1.18: Vi khuẩn Escherichia coli . 37
Hình 1.19: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39
Hình 1.20: Vi khuẩn Salmonella typhi 40
Hình 1.21: Nấm Sclerotium rolfsii 40
Hình 1.22. Đặc điểm cấu tạo nấm Fusarium sp 43
Hình 2.1: Phổ IR của chitosan và các thông số để tính độ deacetyl hóa 47
Hình 2.2. Phổ 1H NMR của N-benzyl chitosan trong dung dịch acid acetic 1% dùng để xác định mức độ thay thế . 51
Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp các N-aryl chitosan 53
Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất amonium bậc bốn của chitosan . 55
Hình 3.1: Khả năng kháng S. aureus MRSA của chitosan và các dẫn xuất chitosan . 71
Hình 3.2. : Khả năng kháng E. coli của chitosan và các dẫn xuất chitosan 71
Hình 3.3: Kết quả MIC của chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 74
Hình 3.4: Kết quả MIC của N-Benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 75
Hình 3.5: Kết quả MIC của N-Metyl benzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 78
Hình 3.6: Kết quả MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 79
Hình 3.7: Kết quả MIC của N-Benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 81

Hình 3.8: Kết quả MIC của N-Metyl benzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 83
Hình 3.9: Kết quả MIC của N-Hydroxylbenzyl chitosan-Quat trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 85
Hình 3.10: Đường kính kháng nấm Fusarium sp của N Hydroxylbenzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 99
Hình 3.11: Đường kính kháng nấm Sclerotium rolfsii của N Hydroxylbenzyl chitosan-Quat ở các nồng độ khác nhau 99


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ và độ nhớt của chitosan 46
Đồ thị 3.2: Năng lực khử của chitosan và các dẫn xuất của chitosan . 103
Đồ thị 3.3: Hiệu suất kháng gốc hydroxyl tự do của chitosan và các dẫn xuất ở các nồng độ khác nhau 106

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình thí nghiệm . 62

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biều đồ 3.1: Kết quả MIC của chitosan và các dẫn xuất trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm . 86
Biểu đồ 3.2: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ chitosan . 88
Biểu đồ 3.3: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Benzyl chitosan .90
Biểu đồ 3.4: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Metylbenzyl chitosan . 92

Biểu đồ 3.5: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Hydroxylbenzyl chitosan . 94
Biểu đồ 3.6: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Benzyl chitosan-Quat . 95
Biểu đồ 3.7: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Metylbenzyl chitosan-Quat . 97
Biểu đồ 3.8: Mối tương quan giữa hiệu suất kháng nấm và nồng độ N-Hydroxyl benzyl chitosan-Quat . 98
Biểu đồ 3.9: Hiệu suất kháng nấm Fusarium sp của chitosan và các dẫn xuất ở nồng độ 500 và 1000 µ g/ml 100
Biểu đồ 3.10: Hiệu suất kháng nấm Sclerotium rolfsii của chitosan và các dẫn xuất ở nồng độ 500 và 1000 µ g/ml 101


MỞ ĐẦU

Chitin là một polymer sinh học có trong tự nhiên với trữ lượng rất lớn, chỉ đứng sau cellulose. Chitin không chỉ có nhiều trong vỏ các loại tôm, cua, mai mực mà còn là thành phần chính của vách tế bào nhiều loại nấm. Các nguồn chitin nếu không được xử lý đúng cách sẽ tạo ra nguồn chất thải lớn ra môi trường và gây ô nhiễm. Do đó, nếu các nguồn chitin này được tận dụng một cách khoa học thì không những tạo ra được những hợp chất mới có những hoạt tính ưu việt mà còn tránh lãng phí và giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường.

Chitosan là một polymer sinh học được tạo ra từ phản ứng deacetyl hóa chitin. Trên thế giới hiện nay ngày càng có nhiều những công trình nghiên cứu về loại polymer sinh học này, do chitosan có những tính chất ưu việt mà không một loại polymer nào khác có được. Chitosan không gây độc hại đến cơ thể con người, có khả năng tương hợp với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có những hoạt tính quý báu như hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh, kháng oxy hóa. Ngoài ra, các nhà khoa học đã tổng hợp nên những dẫn xuất mới có hoạt tính tốt hơn so với chitosan, thậm chí các dẫn xuất này còn có những hoạt tính mới mà chitosan ban đầu không có. Gần đây, chitosan và các dẫn xuất còn được phát hiện thêm nhiều đặc tính ưu việt khác như khả năng dẫn truyền và giải phóng thuốc ứng dụng trong dược phẩm, khả năng liên kết với DNA ứng dụng trong vector chuyển gen, ứng dụng trong kỹ thuật mô.

Vì thế, hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của chitosan đang thu hút rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong khi đó, ở Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện hướng nghiên cứu này nhằm tìm ra những dẫn xuất mới có những đặc tính mới và ưu việt hơn, từ đó ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau. Các hoạt tính thường được nghiên cứu là hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa, để từ đó có thể ứng dụng vào trong lĩnh vực nông nghiệp, thực phẩm, thậm chí y dược.




Vì vậy mục đích nghiên cứu của đề tài này là chúng tôi tạo các dẫn xuất của chitosan với các aldehyde thơm, chitosan với Quat và khảo sát một số hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này. Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi thực hiện các nội dung sau:
- Tổng hợp các dẫn xuất chitosan với aldehyde thơm, tổng hợp dẫn xuất chitosan với Quat.
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất.

- Khảo sát hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất.

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan và các dẫn xuất.