Luận Văn Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba t

TÓM TẮT
​

Đề tài “Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện. Địa điểm: trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007. Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng. Việc phát triển các phương pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân tử mới đã được phát triển như những phương pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trường. Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea victoria đã được chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất. Những dòng Pseudomonas fluorescens được đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Nội dung nghiên cứu
1. Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trường KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu.
2. Khảo sát các điều kiện tối ưu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần.
3. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp.
Kết quả đạt được
Chọn được dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích nghiên cứu. Đạt được quy trình tối ưu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần.



MỤC LỤC
Chương 1 1
MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 3
Chương 2 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn 4
2.1.1 Giới thiệu 4
2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn 4
2.1.2.1 Biến nạp (transformation) 4
2.1.2.2 Tải nạp (transduction) 5
2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) 7
2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic element_TGE) 10
2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị 11
2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị 11
2.2 Plasmid 13
2.3 Các phương pháp thường dùng để chuyển DNA plasmid 15
2.3.1 Phương pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) 15
2.3.2 Phương pháp điện biến nạp 16
2.3.2.1 Phương pháp 16
2.3.3 Phương pháp Calcium chloride18
2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học 19
2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20
2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20
2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 21
2.6 Protein GFP 24
2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm 24
2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp 25
Chương 3 28
VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 28
3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 28
3.2.1 Vật liệu 28
3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp 28
3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 29
3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 29
3.2.2 Các loại môi trường dùng trong nuôi cấy vi khuẩn 31
3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu 31
3.3 Phương pháp nghiên cứu 31
Chương 4 34
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
4.1 Kết quả 34
4.1.1 Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn 34
4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trường KB 36
4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần 37
4.1.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 37
4.1.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn 38
4.1.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trường KB 39
4.1.3.4 Kết quả đối chứng 40
4.2 Thảo luận 41
4.2.1 Các thông số tối ưu cho quá trình tiếp hợp 41
4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần 41
4.2.3 Môi trường tối ưu cho chọn lọc 43
4.2.4 Kết quả đối chứng 42
4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ưu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 44
Chương 5 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
5.1 Kết luận 47
5.2 Đề nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC 51