Luận Văn Tối ưu quá trình thuỷ phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase và đặc trưng tín

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Tối ưu quá trình thuỷ phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase và đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC . ii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC TỪVIẾT TẮT .vii
MỞĐẦU . 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN . 3
1.1 Tổng quan phếliệu tôm . 3
1.1.1 Phếliệu tôm trong chếbiến thủy sản . 3
1.1.2 Thành phần hóa học của phếliệu tôm . 3
1.1.3 Enzyme protease của tôm [6]. 5
1.1.4 Các phương pháp thu nhận protein từphếliệu tôm . 7
1.1.5 Các nghiên cứu vềviệc thu hồi protein bằng enzyme 8
1.2 Tổng quan vềchất chống oxi hóa . 10
1.2.1 Khái quát chung vềgốc tựdo và chất chống oxi hóa . 10
1.2.1.1 Gốc tựdo, và sựoxy hoá. 10
1.2.1.2 Chất chống oxi hóa . 11
1.2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 12
1.2.2.1 Các phương pháp HAT 12
1.2.2.2 Các phương pháp ET 13
1.2.3 Tình hình nghiên cứu khảnăng chống oxi hóa từphếliệu thủy sản . 14
1.2.4 Ứng dụng của chất chống oxi hóa trong thực phẩm . 15
1.3 Tổng quan vềenzyme protease . 15
1.3.1 Phân loại và đặc điểm các loại enzyme protease 15
iii
1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 18
1.3.3 Ứng dụng của enzyme protease . 20
1.4 Tổng quan vềenzyme Alcalase . 21
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
2.1 Đối tượng nghiêncứu . 22
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm . 22
2.1.2 Hóa chất . 22
2.2 Phương pháp nghiên cứu và xửlý sốliệu 22
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1.1 Phương pháp bốtrí thí nghi ệm . 22
2.2.1.2 Phương pháp phân tích các chỉtiêu . 23
2.2.2 Phương pháp xửlí sốliệu . 27
2.3 Bốtrí thí nghiệm . 27
2.3.1 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của việc xửlí nhi ệt đối với nguyên liệu
trước khi thủy phân . 27
2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tốthủy phân . 29
2.3.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng enzyme Alcalase 33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 35
3.1 Ảnh hưởng của xửlí nhiệt trước khi thủy phân và bổsung enzyme alcalase
đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân 35
3.2 Ảnh hưởng của xửlí nhiệt trước khi thủy phân đến khảnăng chống oxi hóa
của dịch thủy phân 36
3.3 Ảnh hưởng của các yếu tốđến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy
phân protein đầu tôm . 37
3.4 Ảnh hưởng của các yếu tốđến khảnăng chống oxi hóa của dịch thủy phân
protein đầu tôm . 41
iv
3.5 Kết quảtối ưu quá trình thủy phân đểthu dịch thuỷphân có khảnăng khử
gốc tựdo DDPH . 45
3.6 Đặc trưng tính chất của dịch thủy phân . 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤLỤC
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phếliệu tôm thẻchân trắng 4
Bảng 2.1 Thểtích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm 25
Bảng 2.2 Thểtích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm . 26
Bảng 2.3 Ma trận thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xửlý nhi ệt ban đầu . 29
Bảng 2.4 Thiết kếmức thực nghiệm của các tham sốtrong quy trình xác định ảnh
hưởng của các yếu tốtới quá trình thủy phân . 31
Bảng 2.5 Mô hình thí nghi ệm xác đị nh các y ếu tố ảnh hư ởng tới quá trình th ủy phân 31
Bảng 2.6 Thiết kếmức thực nghiệm của các tham sốtrong tối ưu theo phương pháp
Box-Behnken . 34
Bảng 2.7 Mô hình thí nghiệm tối ưu theo phương pháp Box-Behnken 34
Bảng 3.3 Kết quảphân tích mức độ ảnh hưởng của yếu tốđến hàm lượng protein
hòa tan của dịch thủy phân protein đầu tôm trên phần mềm DX8 38
Bảng 3.4 Kết quảphân tích tương tác giữa các yếu tốđến khảnăng chống oxi hóa
của dịch thủy phân protein đầu tôm . 41
Bảng 3.5 Kết quảnghiên cứu tối ưu theo mô hình Box-Behnken . 45
Bảng 3.6 Kết quảphân tích sựtương thích của mô hình bậc hai đối với hàm lượng
protein hòa tan . 46
Bảng 3.7 Kết quảphân tích sựtương thích của mô hình bậc hai đối với hàm lượng
DDPH bịkhử . 46
Bảng 3.8 Một sốchỉ tiêu phân tích của dị ch thủy phân protein t ừphếli ệu đầu tôm 48
Bảng 3.9 Thành phần acid amin của dịch thủy phân protein từphếliệu đầu tôm
bằng enzyme Alcalase 49
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cơ chếhoạt động của chất chống oxi hóa [22] 11
Hình 1.3 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tửProtein 16
Hình 1.4 Phân loại enzyme protease [8] 16
Hình 2.1 Sơ đồbốtrí trí thí nghiệm tổng quát 23
Hình 2.3 Sựbắt màu của phản ứng Biuret 24
Hình 2.5 Quy trình nghiên cứu ảnh hưởng của xửlý nhiệt trước thủy phân 27
Hình 2.6 Quy trình xem xét ảnh hưởng của các yếu tốthủy phân . 30
Hình 2.7 Quy trình thí nghiệm tối ưu 33
Hình 3.2 Ảnh hưởng của xửlí nhiệt ban đầu đến hàm lượng DDPH bịkhử 36
Hình 3.3 Kết quảphân tích ảnh hưởng của các yếu tốđến hàm lượng protein hòa
tan của dịch thủy phân protein đầu tôm trên đồthịHalf-Normal . 38
Hình 3.4 Phân tích ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein hòa tan trên
phần mềm DX8 39
Hình 3.5 Phân tích ảnh hưởng của nhiệt độđến hàm lượng protein hòa tan trên
phần mềm DX8 40
Hình 3.6 Kết quảphân tích Half-Normal đánh giá ảnh hưởng của các yếu tốđến
khảnăng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein đầu tôm trên phần mềm DX8 41
Hình 3.7 Phân tích ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch
thủy phân bằng phần mềm DX8 . 42
Hình 3.8 Kết quảphân tích ảnh hưởng của nhiệt độđến hoạt tính chống oxi hóa của
dịch thủy phân trên phần mềm DX8 43
Hình 3.9 Kết quảphân tích ảnh hưởng nồng độenzyme đến hoạt tính chống oxi hóa
của dịch thủy phân trên phần mềm DX8 . 44
Hình 3.10 Bềmặt đáp ứng tối ưu quá trình thủy phân . 47
vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DDPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
HAT: Hydrogen Atom Transfer
ET: Electron Transfer
AAPH: 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride
1
MỞ ĐẦU
Việt Nam cóbờbiển dài khoảng hơn 3.200km vàhơn 236.972 ha mặt nước
nuôi trồng thủy sản đã tạo tiền đềcho ngành chếbiến thủy sản phát triển mạnh mẽ.
Hiện nay, chếbiến thủy sản không những đem lại lợi nhuận cao đóng góp ngân sách
cho nhà nước mà còn giải quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao động. Theo
Hiệp Hội Chếbiến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 6 tháng đầu
năm 2011, cảnước đã xuất khẩu 10.872 tấn tôm, trịgiá 971.109 triệu USD, tăng
16,9% vềkhối lượng và 35,2% vềgiá trịso với cùng kì năm 2010 và là nhóm hàng
có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủlực của
Việt Nam. Đi đôi với việc tăng sản lượng tôm xuất khẩu là lượng phếliệu tôm thải
ra cũng tăng lên. Tuy nhiên,việc khai thác các sản phẩm có giá trịsinh học từ
protein đầu tôm chưa được đầu tư nghiên cứu nhiều ởnước ta, protein chủyếu mới
chỉđược tận thu như một dạng sản phẩm phụcủa quá trình sản xuất chitin đểlàm
thức ăn gia súc. Điều này không những gây lãng phí tài nguyên mà còn ảnh hưởng
lớn đến môi trường.
Min – Soo Heu và cộng sự(2003); Seymour &Li (1996) đã chỉra rằng dịch
thủy phân protein từphếliệu đầu tôm có chứa thành phần acid amin khá cao và có
giá trịvềmặt sinh học. Vì vậy, việc nghiên cứutối ưu quá trìnhthu hồi các sản
phẩm có hoạt tính sinh họctừprotein đầu tôm là rất cần thiết, vì không những vừa
nâng cao hiệu quảsửdụng tài nguyên mà còn góp phần khuyếnkhíchcải tiến công
nghệsản xuất chitin ởViệt Nam theo hướng thân thiện với môi trường.
Xuất phát từnhững vấn đềtrên đềtài “Tối ưu quá trình thuỷphân protein
trên đầu tôm thẻchân trắng bằng enzyme Alcalase và đặc trưng tính chất của
dịch thuỷphân” được thực hiện nhằm xác định chếđộthu hồi và đánh giá hoạt
tính sinh học của dịch thu được khi thủy phân đầu tôm bằng enzyme Alcalase, một
enzyme vẫn thường được dùng đểthủy phân đầu tôm hiện nay, từđó mởra hướng
ứng dụng sản phẩm thủy phân này vào trong thực phẩm và thực phẩm chức năng.
2
Nội dung của đềtài:
 Đánh giá ảnh hưởng của việc xửlý nhiệt nguyên liệutrước thủy phân.
 Đánh giá ảnh hưởng củacác yếu tốđến hàm lượngprotein hòa tan và khả
năng chống oxi hóa của dịch thủy phân đầu tôm.
 Tối ưu quá trình thuỷphân protein bằng enzyme Alcalase đểthu dịch có
hoạt tính chống oxi hóa cao trên đầu tôm thẻchân trắng.
 Đánh giá giá trịdinh dưỡng và giá trịsinh học của dịch thuỷphân.
3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan phếliệu tôm
1.1.1 Phếliệu tôm trong chếbiến thủy sản
Phếliệu tôm chủyếu là đầu, vỏvà đuôi tôm, ngoài ra còn có phần thịt tôm do
lột vỏsai quy cách hoặc tôm biếnmàu. Tùy thuộc vào từng loài, sản phẩm chếbiến
khác nhau mà lượng phếliệu tôm thu được khác nhau. Chẳng hạn, đối với tôm càng
xanh Macrobrachium rosenbergii, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm. Đầu
tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm. Đối với tôm thẻ,
lượng phếliệu đầu tôm chiếm khoảng 28%. Lượng phếliệu này có thểgiảm bằng
cách cải tiến thiết bịvà công nghệ.
Việc tiêu thụmột lượng lớn tôm nguyên liệu của các nhà máy chếbiến thủy
sản đã thải ra một lượng lớn phếliệu, chủyếu là đầu tôm và vỏtôm. Các loại phế
liệu này nếu thải trực tiếp ra môi trường sẽgây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng
và nếu đem xửlí chất thải thì chi phí sẽrất lớn.Ngày nay, đã có nhiều hướng
nghiên cứu sửdụng phếliệu tôm đểsản xuất các chếphẩm có giá trịquan trọng như
chitin-chitosan, Asthaxanthin.
1.1.2 Thành phần hóa học của phếliệu tôm
Trong phếliệu tôm có chứa những thành phần quan trọng có giá trịnhư
protein, chitin, canxi cacbonate Tỷlệgiữa các thành phần này không ổn định,
chúng thay đổi theo giống, loài, đặc điểm sinh thái, mùa vụ Thành phần hoá học
cơ bản của phếliệu tôm thẻchân trắng được nghiên cứu bởi Trang Sĩ Trung (2009)
thểhiện trong bảng 1.1.
4
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phếliệu tôm thẻchân trắng
STT Thành phần Hàm lượng
1 Độ ẩm (%) 77,5 ± 1,2
2 Hàm lượng tro tổng số
a
(%) 24,6 ± 0,8
3 Hàm lượng chitin
a
(%) 18,3 ± 0,9
4 Hàm lượng protein
a
(%) 47,4 ± 1,8
5 Hàm lượng lipid
a
(%) 4,7 ± 0,3
6 Hàm lượng asthaxanthin
a
(ppm) 130 ± 13,9
a
: Tính theo chất khô tuyệt đối
 Protein: Protein đầu tôm thường tồn tại ở2 dạng chính là dạng tựdo (có
sẵn trong nội tạng và phần cơ thịt còn sót lại gắn với đầu tôm) và dạng liên kết với
chitin hoặc canxi carbonate như một phần thống nhất của vỏđầu tôm.
 Chitin: Chiếm khối lượng lớn (18,3%). Tồn tại dưới dạng liên kết với
protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác.
 Hệenzyme: Trong đầu tôm có chứa hệenzyme hoạt động mạnh đặc biệt là
ởnội tạng, do đórất dễbịhư hỏng. Một sốenzyme ởđầu tôm gồm:
- Protease: Là enzyme chủyếu trong đầu tôm, phângiải protein thành
acid amin.
- Lipase: phân giải lipid thành glyceryl và acid béo
- Tyrosinase: khi có mặt của oxi không khí sẽbiến đổi tyrosine thành
melanin có màu đen ảnh hưởng tới giá trịcảm quan và chất lượng sản phẩm.
 Chất ngấm ra ởđầu tôm: Trimethylamin (TMA), Trimethylamin oxyt
(TMAO), ure, các acid amin tựdo
Ngoài các thành phần trên trong đầu tôm còn có một lượng nhỏlipid, photpho
và sắc tố.
Như vậy, phếliệu đầu tôm vừa là nguồn giàu chitin (11% trọng lượng khô)
vừa là một nguồn protein tốt (50 –60% trọng lượng khô), có nhiều giá trịdinh
dưỡng và nguồn enzyme.
5
Qua bảng phân tích thành phần phếliệu tôm (Bảng 1.2) cho thấy hàm lượng
protein trong phếliệu tôm là khá lớn và như chúng ta đã biết protein có rất nhiều
ứng dụng trong thực tế. Vì vậy việc thu hồi lượng protein từphếliệu đầu tôm là rất
có nghĩa.
1.1.3Enzyme protease của tôm [6].
Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt các enzyme tiêu hóa ở protein ở giáp xác nói
chung và ở tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Protease
của tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng
trypsin vàcó khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin,
astacine, collagenase
Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sinh khác là các protease nội
bào, nó tập trung nhiều nhất ởcơ quan tiêu hóa, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc
biệt ởtôm do đặc điểm hệtiêu hóa nội tạng nằm ởphần đầu nên hệenzyme sẽtập
trung nhiều nhất ởphần đầu sau đó đến các cơ quan khác. Các enzyme có tác dụng
thủy phân protein, tính đặc hiệu rộng rãi, không chỉthủy phân các liên kết peptide
mà còn thủy phân cảliên kết este, liên kết amin . Phần lớn các enzyme thuộc
protease của tôm thường có tính chất chung của một protease:
- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate
trung tính, đệm Tris-HCl và một sốdung môi hữu cơ khác, nên dựa vào những đặc
tính này đểtách chiết chúng.
- Bịkết tủa thuận nghịch bởi một sốmuối trung hòa (sulfate amonium),
ethanol, acetone đểthu nhận chếphẩm enzyme.
- Hoạt tính của enzyme có thểtăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất
hoạt hóa hay ức chế.
- Độhoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ,
pH môi trường.
Trypsin:Có nhiều trong dịch vị tụy tạng, có tác dụng mạnh với các loại
protid có phân tử lượng thấp ở các mối liên kết peptide, amit, este. Trypsin từ ruột
tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 38
o
C.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
 Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm ThịTrân Châu, Nguyễn Văn Ngoạn, Phan ThịHà, Nguyễn Văn Lệ, Vũ
Thanh Hoa (1993), Protease đầu tôm biển, Tạp chí thủy sản, số5, tr. 10-13.
2. Nguyễn LệHà (2009), Một sốtính chất của enzyme và ứng dụng trong tách chiết
proteasetừđầu tôm sú, Chuyên đềTiến sĩ, Tr ường Ðại học Nha Trang.
3. Đặng ThịHiền(2008), nghiên cứu sản xuất chitin –chitosan theo phương pháp
sinh học. luận văn thạc sĩ kĩ thuật trường Đại học Nha Trang.
4. Đặng Văn Hợp, ĐỗMinh Phụng, (1997). “Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy
sản”, trư ờng Đại học Nha Trang.
5. Nguyễn Văn Lệ(1996), Nghiên cứu sửdụng protease đầu tôm trong chếbiến
thủy sản, Luận án phó tiến sỹkhoa học sinh học, Ðại học Khoa học tựnhiên, Ðại
học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
6. ĐỗVăn Ninh (2004), Luận văn tiến sĩ kĩ thuật Trường Đại học Nha Trang.
7. Nguyễn Hoàng Bảo Trung (2011) “Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt dộvà pH đến
khảnăng thủy phân protein của hệenzyme protease trong dị ch chiết đầu tôm thẻ
chân trắng”Đồán tốt nghiệp –Đại học Nha Trang
8. Trang Sĩ Trung (2009), Đánh giá chất lượng sản phẩm và hiệu quảmôi trường
của qui trình sản xuất chitin cải ti ến kết hợp xửlí enzyme , Tạp chí khoa học –
công nghệthủy sản số1.
9. Nguyễn Văn Truyền (2006), Nghiên cứu chiết xuất protease từđầu tôm càng
xanh, Luận văn Thạc sĩ kỹthuật, Truờng Ðại học Thủy Sản, Nha Trang.
 Tài liệu tiếng Anh
10. B.Halliwell, R.Aeschbacht, J.Loligert & O.I. Aruoma. The characterization of
antioxidants. Fd Chem. Tox, vol. 33, No. 7. Pp. 601 –617. 1995).
52
11. Doke S.N., Ninjoor V. (1989), “Characteristics of an alkaline protease and
exopeptiddase from shimp (Pennaeus indicus) muscle”,J.Food Sci.,Volume 52,
No.5, pp. 517-526.
12. Hui –Chun Wu, Hua-Ming Chen, Chyuan-Yuan Shiau. Free aminoacids and
peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel
(Scomber Austriasicus). Food research International 36 (2003) 949-957
13. Huynh N.D. Bao, Yoshihiro ochiai, Toshiaki Ohshima. Antioxidative activities
of hydrophilic extracts prepared from thefruiting body and spent culture medium
of Flammulina velutipes. Bioresource Technology 101 (2010) 6248-6255.
14. Nandhsha Faithong, Soottawat Benjakul, Suttirug Phatcharat, Wanwisa Binsan
Chemical composition and antioxidative activity of Thai traditionalfermented
shrimp and krill products. Food Chemistry, Volume 119, Issue 1, 1 March 2010,
Pages 133-140
15. Mahmoudreza Ovissipour, Ali Motamedzadegan, Barbara Rasco, Abbas
Esmaeili Molla. Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins
of beluga sturgeon Huso huso using Alcalase. Int Aquat Res (2009) 1: 31-38
16. Oyaizu, M,. Studies of products of browning reactions: antioxidative activitives
of products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn. J. Nutr. 1986,
44, 307-315
17.Jiang, S.T., Wang J.H, Cen S.S., (1991), “Purification and some properties of
calpain II from tilapia muscle”, J.Agri.Food.Chem.
18. Jiang, S.T, Moody, M.W and Chen, H.C, (1991), “Purification and
characterization of proteases from digestive tract of grass shrimp (Penaeus
monodon)”,J.Food.
53
19. Thomas A.Seymour, Shiao Jing Li and Michael T.Moissey. Characterization of
a natural antioxidant from Shrimp Shell. Waste. J.Agric Food Chem.
1996.44.682-685
20. W Binsan, S Benjakul, W Visessanguan, S Roytrakul, M Tanaka, H Kishimura
Antioxidative activity of Mungoong, an extract paste, from the cephalothorax of
white shrimp (Litopenaeus vannamei. Food Chemistry (2008)
Volume: 106, Issue: 1, Pages: 185-193
21. Wanwisa Binsan, Soottawat Benjakul, Wonnop Visessanguan, Sittiruk
Roytrakul, Munehiko Tanaka, Hideki Kishimura. Antioxidative activity of
Mungoong, an extract paste, from the cephalothorax of white shrimp
(Litopenaeus vannamei). Food chemistry 106 (2008) Pages 185–193.
 Tài liệu Internet
22. www.amazing-glutathione.com/what-are-antioxidants.html
- http://thuysanvietnam.com.vn/index.php/news/details/index/1780.let
- http://www.rimf.org.vn/bantin/tapchi_newsdetail.asp?TapChiID=36&muctin_id
=2&news_id=2555
- http://en.wikipedia.org/wiki/Antioxidant